淫羊藿苷元的腸道跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

慈小燕，孫英輝，武衛(wèi)黨，曾 勇，劉昌孝，伊秀林*，閆鳳英*

淫羊藿苷元的腸道跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

慈小燕1, 2, 3，孫英輝1, 2，武衛(wèi)黨1, 2，曾 勇1, 2，劉昌孝1, 2，伊秀林1, 2*，閆鳳英1, 2, 3*

1.天津藥物研究院 釋藥技術(shù)與藥代國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物代謝新技術(shù)創(chuàng)新單元，北京 100730 3.天津和創(chuàng)生物技術(shù)有限公司，天津 300301

探討淫羊藿苷元（icaritin，ICT）在腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，并闡明ICT生物利用度低的主要原因。采用體外細(xì)胞模型人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞及小腸癌LS-180細(xì)胞和人藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞系 [P-糖蛋白（P-glycolprotein，P-gp，又名MDR1）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）過表達(dá)的狗腎細(xì)胞系MDCK-MDR1、MDCK-BCRP、MDCK-MRP2及空白轉(zhuǎn)染的狗腎細(xì)胞系MDCK-mock；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽2B1（organic anion transporting polypeptides 2B1，OATP2B1）過表達(dá)的人胚胎腎細(xì)胞HEK293-OATP2B1及空白轉(zhuǎn)染的人胚胎腎細(xì)胞HEK293-mock]，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR、LC-MS/MS聯(lián)用、放射性同位素示蹤等技術(shù)，共同研究淫羊藿苷元在腸道的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。Caco-2細(xì)胞研究中，ICT在低濃度給藥時(shí)攝入方向表觀滲透系數(shù)（app）較小，滲透性較弱，存在明顯外排，且外排可被BCRP抑制劑明顯抑制，不能被P-糖蛋白（P-glycolprotein，P-gp）抑制劑明顯抑制，隨著給藥濃度的增加，外排逐漸減弱，攝入方向app逐漸增加，滲透性逐漸增強(qiáng)。通過人藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞系研究，ICT可顯著抑制BCRP和OATP2B1的轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)BCRP和OATP2B1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為6.33、31.8 μmol/L；同時(shí)，ICT是BCRP和OATP2B1的底物。通過LS-180細(xì)胞誘導(dǎo)研究表明，ICT不能誘導(dǎo)腸道外排蛋白P-gp、BCRP的表達(dá)上調(diào)。ICT在腸內(nèi)通過被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)2種機(jī)制吸收，其中被動(dòng)擴(kuò)散能力弱，主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)包括外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP的外排和攝入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OATP2B1攝入共同介導(dǎo)，且對(duì)腸道外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白無誘導(dǎo)表達(dá)功能。BCRP的外排對(duì)ICT吸收影響有限，這可能與ICT的給藥濃度及BCRP的飽和濃度有關(guān)。

淫羊藿苷元；腸道吸收；轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制；Caco-2細(xì)胞；LS-180細(xì)胞；P-糖蛋白；乳腺癌耐藥蛋白；多藥耐藥相關(guān)蛋白2；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽2B1

淫羊藿苷元（icaritin，ICT）是從小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿中提取的一種多羥基黃酮類化合物，為淫羊藿苷水解物。ICT是一種毒性較低且高效的癌癥治療劑[1]，對(duì)急性髓系白血病、惡性淋巴瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌等具有明顯的抗腫瘤作用[2-7]。但I(xiàn)CT的溶解性差，口服生物利用度低，且對(duì)其腸道吸收機(jī)制尚無全面報(bào)道。

藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的方式主要包括細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)（paracellular transport）和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（transcellular transport）；跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)又可分為被動(dòng)擴(kuò)散和轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（transporter mediated transport）。藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)可能采取單一轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制吸收，也可兼有幾種轉(zhuǎn)運(yùn)方式。大多數(shù)藥物通常首先采取被動(dòng)擴(kuò)散，其次采取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。腸道細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在腸道吸收中起著重要甚至決定性的作用[8-9]。在人體腸道中表達(dá)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 [如P-糖蛋白（P-glycolprotein，P-gp，又名MDR1）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）] 和攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2B1 [如有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（organic anion transporting polypeptides 2B1，OATP2B1）和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（peptide transporter 1，PEPT1）][10]。ICT是一種多羥基黃酮類化合物，不具有PEPT1的底物結(jié)構(gòu)特性（含有肽樣結(jié)構(gòu)）。因此，本研究僅探討ICT與P-gp、BCRP、MRP2和OATP2B1之間的關(guān)系。

本研究采用體外細(xì)胞模型結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞和人轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞系（MDR1、BCRP、MRP2過表達(dá)的狗腎細(xì)胞系MDCK-MDR1、MDCK-BCRP、MDCK-MRP2和OATP2B1過表達(dá)的人胚胎腎細(xì)胞HEK293-OATP2B1及空白轉(zhuǎn)染的人胚胎腎細(xì)胞HEK293-mock），共同研究ICT的吸收機(jī)制。此外，還使用小腸癌LS-180細(xì)胞系研究ICT對(duì)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的誘導(dǎo)，以確認(rèn)是否存在由外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)上調(diào)引起的生物利用度降低機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

ICT（中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%，批號(hào)16052601），內(nèi)標(biāo)乙氧苯柳胺（中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%，批號(hào)100680-200901）；3H-普萘洛爾、3H-地高辛、3H-硫酸雌酮（estrone sulfate，ES）、3H-雌二醇葡糖苷酸（estradiol glucuronide，EG）（美國ARC公司，批號(hào)分別為160721、160624、140331、141231）；14C-PEG4000（Perkin Elmer公司，批號(hào)2195563），維拉帕米、BCRP抑制劑Ko143、利福平、波生坦、沙奎那韋、環(huán)孢素A（美國MCE公司，批號(hào)分別為18578、03621、11246、15327、160708、11724）；DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液（100×）、Phosphate Buffered Saline（PBS，1×）、HBSS（含鈣鎂）、含EDTA的0.25%胰酶、胎牛血清（美國Gibco公司）；Transwell 12孔聚碳酸酯膜轉(zhuǎn)運(yùn)板、膠原蛋白包被板（美國Coning公司）。

1.2 儀器

Olympus-CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；Millcell ERS-2跨上皮電阻儀，美國Millipore公司；Tri-Carb 2910 TR放射性液體閃爍儀，PerKinElmer公司；ZHWY-上海智誠恒溫振蕩器，北京華威興業(yè)科技有限公司；Sorvall Legend Micro 17R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；Agilent1100 HPLC-UV系統(tǒng)，日本安捷倫公司；LCMS-8060超快速三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，配有LC-30AD二元輸送泵、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、DGU-20A5R真空脫氣機(jī)和CTO-20A柱溫箱，日本Shimadzu公司；Mastercycler ep Realplex2實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）儀，德國Eppendorf公司。

1.3 細(xì)胞株

Caco-2細(xì)胞及LS-180細(xì)胞購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞株MDCK-MDR1、MDCK-BCRP、MDCK-mock、HEK293-OATP2B1和HEK293-mock由日本富士生物醫(yī)藥研究所贈(zèng)予；MDCK-MRP2細(xì)胞由大連醫(yī)科大學(xué)劉克辛教授團(tuán)隊(duì)贈(zèng)予。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞系均于培養(yǎng)皿內(nèi)，以DMEM為培養(yǎng)基（含10% FBS、1%青鏈霉素），在37 ℃、5% CO2和相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋盤底80%～90%時(shí)，用含0.25% EDTA的胰酶消化。本實(shí)驗(yàn)所用的Caco-2細(xì)胞為32～35代，LS-180細(xì)胞為22～25代，MDCK-MDR1細(xì)胞為29～30代、MDCK-BCRP細(xì)胞為19～20代、MDCK-MRP2細(xì)胞為22～24代，HEK293-mock細(xì)胞為24～25代，HEK293-OATP2B1細(xì)胞為26～28代。

2.2 MTT測(cè)定

將細(xì)胞接種于96孔板上，在無藥物培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。Caco-2、LS-180、MDCK、HEK293細(xì)胞接種密度分別為5×104/mL、5×104/mL、2.5×104/mL、8×104/mL。之后，加入一系列的ICT，終濃度分別為0.1、0.3、1、3、10、30 μmol/L，與細(xì)胞再孵育48 h。隨后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，孵育20～30 min。最后，在酶標(biāo)儀上測(cè)量反應(yīng)液在490 nm波長處的吸光度。每個(gè)濃度6次重復(fù)。使用GraphPad Prism計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 LC-MS/MS分析

2.3.1 色譜條件 色譜柱為InertSustain Bio C18HP（50 mm×2.1 mm，3 μm），柱溫40℃，流動(dòng)相為甲醇-10%甲醇水溶液（含有0.09%甲酸）（7∶3），等度洗脫，體積流量為0.3 mL/min，進(jìn)樣溫度6℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件 ESI正離子源，噴霧氣體積流量3 L/min，加熱氣體積流量10 L/min，干燥氣體積流量10 L/min，源溫300℃，去溶劑氣溫度250 ℃，加熱模塊溫度400℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）掃描方式：淫羊藿苷元[M＋H]+/369.1→/313.1，碰撞能?30 eV；內(nèi)標(biāo)乙氧苯柳胺[M＋H]+/258.1→/121.1，碰撞能?22 eV。

2.4 樣品制備及處理

精密稱取ICT對(duì)照品適量，用甲醇溶液超聲溶解配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，精密吸取儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋配制成含1 μg/mL的ICT甲醇溶液A，用甲醇梯度稀釋得質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、25、100、500、1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；同時(shí)，用甲醇稀釋配制成含1 μg/mL ICT的甲醇溶液B，用甲醇梯度稀釋得質(zhì)量濃度分別為1、25、800 ng/mL的質(zhì)控溶液。取各樣品溶液50 μL，加入IS 100 μL（乙氧苯柳胺10 ng/mL甲醇溶液），再加入50 μL水，渦旋混勻，取100 μL溶液于內(nèi)插管中，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，上清液進(jìn)樣2 μL，進(jìn)行LC-MS/MS定量分析。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

細(xì)胞樣品中ICT的LC-MS/MS定量分析方法經(jīng)過了完整的方法學(xué)驗(yàn)證，在該分析方法下，細(xì)胞中的其余物質(zhì)不會(huì)干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，ICT的線性范圍分別為0.5～1000 ng/mL，曲線斜率的RSD均小于0.205%，相關(guān)系數(shù)大于0.999，表明在該范圍濃度內(nèi)線性良好。定量下限為0.5 ng/mL，準(zhǔn)確度在90.0%～107%，精密度小于5.52%。低、高2個(gè)質(zhì)量濃度水平的基質(zhì)效應(yīng)在91%～106%，RSD小于10.5%。

2.6 Caco-2細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究

用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞密度至2×105/mL，接種于Transwell聚碳酸酯膜12孔板中。在Caco-2細(xì)胞層頂端（AP）每孔加0.5 mL細(xì)胞懸液，基底端（BL）每孔加1.5 mL新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)21 d，得到完全分化的細(xì)胞單層。

用3種已知特性的工具藥[3H-普萘洛爾（高滲）、14C-聚乙二醇4000（零滲）和3H-地高辛（外排基質(zhì)）] 驗(yàn)證Caco-2細(xì)胞單層的完整性和功能性。此外，通過使用Millicell-ERS電阻儀測(cè)量跨單層的跨上皮電阻（trans epithellal electric resistance，TEER）來評(píng)估單層的完整性。實(shí)驗(yàn)中僅使用TEER值高于350 Ω/cm2的細(xì)胞單層。

樣品處理：取細(xì)胞液50 μL，加入內(nèi)標(biāo)乙氧苯柳胺10 ng/mL甲醇溶液100 μL，再加入50 μL甲醇溶液，渦旋混勻，取100 μL溶液于內(nèi)插管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液進(jìn)樣2 μL，進(jìn)行LC-MS/MS定量分析。

2.6.1 ICT在Caco-2細(xì)胞中攝入方向的轉(zhuǎn)運(yùn) 吸去Transwell小室AP和BL端的培養(yǎng)基，加入37 ℃預(yù)熱的HBSS溶液，37 ℃平衡20 min；吸去HBSS，在AP端加入0.5 mL預(yù)熱的含有不同濃度（1、5、25 μmol/L）ICT的HBSS溶液，BL端加入1.5 mL空白HBSS溶液；37 ℃恒溫振蕩器孵育，在30 min吸取BL端的轉(zhuǎn)運(yùn)液，LC-MS/MS測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)液中的ICT濃度。按以下公式計(jì)算表觀滲透系數(shù)（apparent permeation coefficient，app）和外排率（efflux ratio，E）。

app＝×(d/d)×1/×1/0

表示接收室的溶液體積（AP端為0.5 cm3、BL端為1.5 cm3），表示膜的面積（1.13 cm2），0表示藥物的起始濃度，d/d表示接收室在單位時(shí)間獲得的藥物濃度，即接收室的最終濃度除以轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間

E＝app(B-A)/app(A-B)

A-B代表AP→BL，B-A代表BL→AP，當(dāng)所測(cè)藥物的E≥2時(shí)，表示藥物可能為腸道外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物，當(dāng)所測(cè)藥物的E≤0.5時(shí)，表示該藥物可能為腸道攝入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物

2.6.2 ICT在Caco-2細(xì)胞中外排方向的轉(zhuǎn)運(yùn) 吸去Transwell小室AP和BL端的培養(yǎng)基，加入37 ℃預(yù)熱的HBSS溶液，37 ℃平衡20 min；吸去HBSS，在AP端加入0.5 mL空白HBSS溶液，BL端加入預(yù)熱的含有不同濃度（1、5、25 μmol/L）ICT的HBSS溶液；37 ℃恒溫振蕩器孵育一段時(shí)間；吸取AP端的轉(zhuǎn)運(yùn)液，LC-MS/MS測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)液中的ICT濃度。計(jì)算app和E。

2.6.3 P-gp抑制劑維拉帕米及BCRP抑制劑Ko143對(duì)ICT在Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 用同時(shí)含有50 μmol/L維拉帕米或0.5 μmol/LKo143和ICT的給藥液代替只含ICT的給藥液即可，其他操作相同。計(jì)算app和E。

2.7 ICT對(duì)人體腸道中表達(dá)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制研究

2.7.1 攝入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 用新鮮DMEM培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞密度至1.5×105/mL，接種于24孔板中，連續(xù)培養(yǎng)2～3 d后，用于抑制實(shí)驗(yàn)。去除培養(yǎng)板內(nèi)DMEM，將HEK293-OATP2B1和HEK293-mock細(xì)胞置于DPBS緩沖液中37 ℃平衡10 min。將含放射性標(biāo)記的探針底物3H-ES（0.05 μmol/L）的陽性抑制劑利福平或不同濃度（0、0.3、1、3、10、30 μmol/L）ICT的給藥混合溶液置換DPBS，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在各細(xì)胞中反應(yīng)2 min。另設(shè)對(duì)照組，給藥液換成只含放射性底物不含抑制劑的溶液。用冷DPBS洗滌3次將抑制實(shí)驗(yàn)終止。然后，將細(xì)胞溶解在0.1 mol/L的NaOH溶液中，提取后在每個(gè)樣品中加入3.5 mL閃爍液，混勻，用液體閃爍分析儀進(jìn)行定量測(cè)定。計(jì)算抑制率，以表征ICT對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用的強(qiáng)弱。

抑制率＝(－0)/(c－0)

c表示對(duì)照組的DPM（每分鐘衰變數(shù)）值，0表示mock細(xì)胞的DPM值，表示各給藥組的DPM值

2.7.2 外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，接種于Transwell 12孔板中。連續(xù)培養(yǎng)7 d，得到完全分化的細(xì)胞單層。實(shí)驗(yàn)中僅使用TEER值高于150 Ω/cm2的細(xì)胞單層。去除培養(yǎng)板內(nèi)DMEM，將MDCK-MDR1、MDCK-BCRP、MDCK-MRP2和MDCK-mock細(xì)胞置于DPBS緩沖液中37 ℃平衡10 min。MDR1、BCRP及MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使用的底物分別為3H-地高辛（1 μCi/mL）、3H-ES（1 μCi/mL）及3H-EG（1 μCi/mL）；抑制劑分別為維拉帕米（100 μmol/L）、Ko143（1 μmol/L）及環(huán)孢素A（30 μmol/L）。將含放射性標(biāo)記探針底物的陽性抑制劑或不同濃度ICT（0、0.3、1、3、10、30 μmol/L）的給藥混合溶液置換DPBS，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在各細(xì)胞中反應(yīng)15 min。另設(shè)對(duì)照組，給藥液換成只含放射性底物不含抑制劑的溶液。取100 μL轉(zhuǎn)運(yùn)液，分別加入3.5 mL閃爍液，混勻，用液體閃爍分析儀進(jìn)行定量測(cè)定。計(jì)算抑制率。

2.8 底物研究

2.8.1 攝入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 考察攝入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞對(duì)ICT的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。實(shí)驗(yàn)操作同“2.7.1”項(xiàng)，將不同濃度（1、10、100 μmol/L）ICT的給藥混合溶液置換DPBS，每個(gè)濃度設(shè)置3復(fù)孔，在HEK293-OATP2B1和HEK293-mock細(xì)胞中反應(yīng)2 min。用冷DPBS洗滌3次將抑制實(shí)驗(yàn)終止，然后吸去DPBS后向24孔板的每孔中加入300 μL甲醇。樣品處理同“2.4”項(xiàng)。

2.8.2 外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 分別用MDCK-MDR1、MDCK-BCRP細(xì)胞研究不同濃度（1、5、25 μmol/L）ICT的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)情況，實(shí)驗(yàn)操作同“2.6”項(xiàng)。

2.9 LS-180細(xì)胞誘導(dǎo)研究

LS-180細(xì)胞以每孔1.5×105/mL的密度接種于12孔板中，在不含藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。然后，用含ICT（1、10、30 μmol/L）的培養(yǎng)基與LS-180細(xì)胞72 h共培養(yǎng)，以添加P-gp、BCRP和MRP2誘導(dǎo)劑利福平（10 μmol/L）、波生坦（10 μmol/L）[11]和沙奎那韋（10 μmol/L）[12]的細(xì)胞分別作為陽性對(duì)照組，而在未添加藥物的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞作為對(duì)照組。然后用TRIzol總RNA提取試劑盒收集細(xì)胞，提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用qRT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，qRT-PCR反應(yīng)體系為Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.75 μL，下游引物（10 μmol/L）0.75 μL，水（PCR-grade）9 μL，cDNA 模板2 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)，60～95 ℃進(jìn)行熔解曲線分析。引物序列見表1。

2.10 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 MTT檢測(cè)

結(jié)果顯示，ICT對(duì)Caco-2細(xì)胞的IC50超過30 μmol/L，表明ICT在0.1～30 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞無損傷；同樣，ICT在相同濃度范圍內(nèi)對(duì)LS-180、MDCK和HEK293細(xì)胞未表現(xiàn)出毒性。

表1 qRT-PCR引物序列

Table 1 Sequences of primers used for qRT-PCR analysis

引物序列 (5’-3’)來源 β-actin-FGGCATCCTCACCCTGAAGTABGI β-actin-RGGGGTGTTGAAGGTCTCAAABGI ABCB1-FCCCATCATTGCAATAGCAGGBGI ABCB1-RTGTTCAAACTTCTGCTCCTGABGI ABCG2-FAGATGGGTTTCCAAGCGTTCATBGI ABCG2-RCCAGTCCCAGTACGACTGTGACABGI ABCC2-FACAGAGGCTGGTGGCAACCBGI ABCC2-RACCATTACCTTGTCACTGTCCATGABGI

BGI代表深圳華大基因股份有限公司

BGI stands for Shenzhen BGI Co., Ltd.

3.2 Caco-2細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究

Caco-2細(xì)胞模型中ICT雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的app和E值如表2所示。ICT攝取的app值逐漸升高，ICT有明顯的外排現(xiàn)象，且隨著濃度的升高，外排現(xiàn)象逐漸消失。當(dāng)ICT濃度為1 μmol/L時(shí)，Ko143可顯著抑制ICT的外排，當(dāng)ICT濃度為25 μmol/L時(shí)，E小于0.5，表明ICT在腸道通過被動(dòng)擴(kuò)散及主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)共同吸收入血，其中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)可能同時(shí)包括外排和攝入2種形式。

3.3 ICT對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制研究

結(jié)果見圖2、3。ICT（0.3～30 μmol/L）對(duì)MRP2介導(dǎo)的3H-EG轉(zhuǎn)運(yùn)活性無明顯抑制作用。在3～30 μmol/L濃度時(shí)，ICT對(duì)P-gp介導(dǎo)的3H-地高辛轉(zhuǎn)運(yùn)活性具有顯著抑制作用（＜0.05、0.01），但I(xiàn)C50＞30 μmol/L。在1～30 μmol/L濃度時(shí)，ICT可顯著抑制BCRP介導(dǎo)的3H-ES的轉(zhuǎn)運(yùn)（＜0.05、0.01），IC50為6.63 μmol/L。當(dāng)ICT濃度為10、30 μmol/L時(shí)，OATP2B1介導(dǎo)的3H-EG轉(zhuǎn)運(yùn)活性受到顯著抑制（＜0.05、0.01），IC50約為30 μmol/L。

表2 淫羊藿苷元在Caco-2細(xì)胞中雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp值和RE值()

Table 2 Papp and RE of ICT bi-directional transport in Caco-2 cell ()

組別濃度/(μmol·L?1)Papp/(×10?6 cm·s?1)REAP→BLBL→AP ICT10.175±0.0210.730±0.0464.16 50.547±0.0740.639±0.0331.17 250.874±0.0430.410±0.0080.47 ICT＋維拉帕米1＋500.177±0.0190.576±0.0283.26 5＋500.613±0.0960.755±0.0621.23 25＋501.040±0.1170.475±0.0380.46 ICT＋Ko1431＋0.50.212±0.0200.419±0.0161.98 5＋0.50.598±0.0820.613±0.0531.03 25＋0.51.160±0.0960.428±0.0300.38

Ver-維拉帕米 CsA-環(huán)孢素A Rif-利福平 與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

圖3 淫羊藿苷元對(duì)BCRP和OATP2B1的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制作用的IC50()

3.4 底物研究

3.4.1 外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 MDCK-MDR1/BCRP細(xì)胞中ICT雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的app和E值見表3。MDCK-BCRP中有明顯的ICT外排，隨著ICT濃度的增加而逐漸減少，且Ko143能顯著抑制ICT的外排。MDCK-MDR1中沒有顯著的ICT外排，加入維拉帕米后也沒有顯著變化。結(jié)果表明ICT是BCRP的轉(zhuǎn)運(yùn)底物。

3.4.2 攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 HEK293-OATP2B1和HEK293-mock細(xì)胞中的ICT轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)果如圖4所示。當(dāng)ICT濃度為30 μmol/L時(shí)，OATP2B1介導(dǎo)的ICT攝取是mock細(xì)胞的2.67倍，ES可顯著抑制HEK293-OATP2B1細(xì)胞對(duì)ICT的攝取。結(jié)果表明ICT是OATP2B1的底物。

3.5 LS-180細(xì)胞誘導(dǎo)研究

陽性對(duì)照利福平、波生坦、沙奎那韋均可分別顯著上調(diào)（）、（）和（）的mRNA表達(dá)水平，但I(xiàn)CT不上調(diào)、和的mRNA表達(dá)水平，即不誘導(dǎo)、或表達(dá)（圖5）。

表3 淫羊藿苷元在MDCK-MDR1細(xì)胞及MDCK-BCRP細(xì)胞中雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp值和RE值()

Table 3 Papp and RE of ICT bi-directional transport in MDCK-MDR1 and MDCK-BCRP cells ()

組別濃度/(μmol·L?1)細(xì)胞Papp/(×10?6 cm·s?1)REAP→BLBL→AP ICT1MDCK-MDR10.415±0.0220.522±0.0411.260 50.547±0.0620.539±0.0320.985 250.574±0.0430.510±0.0420.889 ICT＋維拉帕米1＋500.437±0.0160.506±0.0321.160 5＋500.513±0.0910.475±0.0690.926 25＋500.484±0.0320.478±0.0370.988 ICT1MDCK-BCRP0.156±0.0330.925±0.1255.930 50.352±0.0630.806±0.0472.290 250.433±0.0540.450±0.0671.040 ICT＋Ko1431＋0.50.205±0.0120.517±0.0282.520 5＋0.50.347±0.0770.718±0.0502.070 25＋0.50.571±0.0760.477±0.0360.835

與HEK293-mock細(xì)胞比較：*P＜0.05 **P＜0.01

4 討論

目前研究藥物腸道跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的方法主要有體內(nèi)法、在體法和體外法3種，體內(nèi)法能夠真實(shí)反映藥物的總體吸收情況，但難以從細(xì)胞和分子水平探討藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制；在體法保證了腸道神經(jīng)和血管的完整性，常用于研究藥物的滲透和吸收動(dòng)力學(xué)，但該方法技術(shù)難度大，干擾因素較多[13-14]；體外法簡便易行，實(shí)驗(yàn)條件容易控制，主要用于研究藥物的腸道跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[15-16]。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

Caco-2細(xì)胞在形態(tài)和功能上與腸上皮細(xì)胞相似，可以表達(dá)多種刷狀緣酶、一些細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶和一些內(nèi)源性活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[17-18]。因?yàn)镃aco-2細(xì)胞含有多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[19]，不利于研究單個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)藥物的影響。人轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是特異性過度表達(dá)人類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因并被目標(biāo)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。Caco-2與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞的聯(lián)合使用，可更直觀、更準(zhǔn)確地分析轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在藥物吸收中的作用與貢獻(xiàn)度。但Caco-2因?yàn)槿狈Φ湫偷娜嗽型槭荏w（pregnane X receptor，PXR）和類固醇外源異物受體（steroid and xenobiotic receptor，SXR），因此其不是評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白誘導(dǎo)的好模型。SXR的配體如利福平可增加小腸癌LS-180細(xì)胞上P-gp和CYP3A4的表達(dá)，因此，業(yè)內(nèi)一般用LS-180細(xì)胞系來評(píng)價(jià)P-gp等的誘導(dǎo)[20-21]。

本研究結(jié)果表明，ICT可顯著抑制P-gp、BCRP和OATP2B1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，且ICT也是BCRP和OATP2B1的轉(zhuǎn)運(yùn)底物。因此，ICT在腸道可通過被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收入血。其中，主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)包括BCRP介導(dǎo)的外排和OATP2B1介導(dǎo)的攝取。當(dāng)ICT在低濃度時(shí)外排明顯，在高濃度時(shí)外排出現(xiàn)飽和，且同時(shí)出現(xiàn)OATP2B1介導(dǎo)的攝入。但是，ICT不誘導(dǎo)LS-180細(xì)胞中P-gp、BCRP和MRP2的表達(dá)，推測(cè)不會(huì)通過誘導(dǎo)BCRP的表達(dá)來降低ICT的生物利用度。隨著藥物濃度的增加，ICT的吸收增強(qiáng)，但結(jié)果顯示ICT是低滲透性化合物，這可能是導(dǎo)致其生物利用度低的主要原因。本研究首次系統(tǒng)深入地研究了淫羊藿苷在腸道內(nèi)的吸收機(jī)制和可能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物相互作用，為臨床開發(fā)和應(yīng)用提供可靠的支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] He Y F, Ci X Y, Xie Y,.Potential detoxification effect of active ingredients in liquorice by upregulating efflux transporter [J]., 2019, 56: 175-182.

[2] Dobson P D, Kell D B.Carrier-mediated cellular uptake of pharmaceutical drugs: An exception or the rule? [J]., 2008, 7(3): 205-220.

[3] Du Q, di L Q, Shan J J,.Intestinal absorption of daphnetin by rats single pass perfusion[J]., 2009, 44(8): 922-926.

[4] Fei Y J, Kanai Y, Nussberger S,.Expression cloning of a mammalian proton-coupled oligopeptide transporter [J]., 1994, 368(6471): 563-566.

[5] Guo Y M, Zhang X T, Meng J,.An anticancer agent icaritin induces sustained activation of the extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway and inhibits growth of breast cancer cells [J]., 2011, 658(2/3): 114-122.

[6] He J, Wang Y, Duan F,.Icaritin induces apoptosis of HepG2 cells via the JNK1signaling pathway independent of the estrogen receptor [J]., 2010, 76(16): 1834-1839.

[7] Wang T, Feng X C, Ding L Q,.Metabolic profiling of icaritin in rats using UHPLC-Q/TOF-MS [J]., 2019, 11(2): 185-191.

[8] Hilgendorf C, Ahlin G, Seithel A,.Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines [J]., 2007, 35(8): 1333-1340.

[9] K?nig S K, Herzog M, Theile D,.Impact of drug transporters on cellular resistance towards saquinavir and darunavir [J]., 2010, 65(11): 2319-2328.

[10] Consortium I T, Giacomini K M, Huang S M,.Membrane transporters in drug development [J]., 2010, 9(3): 215-236.

[11] Lee J B, Zgair A, Taha D A,.Quantitative analysis of lab-to-lab variability in Caco-2 permeability assays [J]., 2017, 114: 38-42.

[12] Lennern?s H.Animal data: The contributions of the Ussing Chamber and perfusion systems to predicting human oral drug delivery[J]., 2007, 59(11): 1103-1120.

[13] Li Q H, Huai L, Zhang C P,.Icaritin induces AML cell apoptosis via the MAPK/ERK and PI3K/AKT signal pathways [J]., 2013, 97(5): 617-623.

[14] Li Q, Sai Y, Kato Y,.Influence of drugs and nutrients on transporter gene expression levels in Caco-2 and LS180 intestinal epithelial cell lines [J]., 2003, 20(8): 1119-1124.

[15] Li Z J, Yao C, Liu S F,.Cytotoxic effect of icaritin and its mechanisms in inducing apoptosis in human Burkitt lymphoma cell line [J]., 2014, 2014: 391512.

[16] Sai Y, Tsuji A.Transporter-mediated drug delivery: Recent progress and experimental approaches [J]., 2004, 9(16): 712-720.

[17] Shah P, Jogani V, Bagchi T,.Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption [J]., 2006, 22(1): 186-198.

[18] Sugano K, Kansy M, Artursson P,.Coexistence of passive and carrier-mediated processes in drug transport [J]., 2010, 9(8): 597-614.

[19] Walsh K R, Failla M L.Transport and metabolism of equol by Caco-2 human intestinal cells [J]., 2009, 57(18): 8297-8302.

[20] Weiss J, Herzog M, Haefeli W E.Differential modulation of the expression of important drug metabolising enzymes and transporters by endothelin-1 receptor antagonists ambrisentan and bosentan[J]., 2011, 660(2/3): 298-304.

[21] Zhao H, Guo Y M, Li S,.A novel anti-cancer agent Icaritin suppresses hepatocellular carcinoma initiation and malignant growth through the IL-6/Jak2/Stat3 pathway [J]., 2015, 6(31): 31927-31943.

Study on transmembrane transport mechanism of icariin in intestine

CI Xiao-yan1, 2, 3, SUN Ying-hui1, 2, WU Wei-dang1, 2, ZENG Yong1, 2, LIU Chang-xiao1, 2, YI Xiu-lin1, 2, YAN Feng-ying1, 2, 3

1.State Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 2.Research Unit for Drug Metabolism, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730, China 3.Tianjin Hechuang Biotechnology Co., Ltd., Tianjin 300301, China

To explore the transport mechanism of icaritin (ICT) in the intestine and clarify the main reasons for the low bioavailability of ICT.cell models including Caco-2 and LS-180 cells and human drug transporter-transfected cell models includingP-glycolprotein (P-gp, also known as MDR1), breast cancer resistance protein (BCRP), multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2) overexpressed in canine kidney cell lines MDCK-MDR1, MDCK-BCRP, MDCK-MRP2, and blank transfected canine kidney cell line MDCK-mock; organic anion transporting polypeptides 2B1 (OATP2B1) overexpressed human embryonic kidney cells HEK293-OATP2B1 and blank transfected human embryonic kidney cells HEK293-mock were used.Real-time quantitative fluorescence PCR, LC-MS/MS, radioisotope tracer and other techniques were used to study the transmembrane transport mechanism of ICT in intestinal tract.In the study of Caco-2 cell, the apparent permeability coefficient (app) of ICT in the direction of intake was small and the permeability was weak at low concentrations, and its efflux could be significantly inhibited by BCRP inhibitors, but not by P-gp inhibitors.With the increase of the concentration of administration, the efflux gradually weakened, the intake direction ofappgradually increased, and the permeability gradually increased.Through the study of the human drug transporter cell line, ICT could significantly inhibit the transport of BCRP and OATP2B1, with IC50values of 6.33 and 31.8 μmol/L, respectively.ICT was the substrate of BCRP and OATP2B1.LS-180 cell induction study showed that ICT could not induce up-regulation of the expression of intestinal efflux protein P-gp and BCRP.ICT is absorbed in intestine through passive diffusion and active transport, of which passive diffusion capacity is weak.The active transport is mediated by efflux of BCRP and uptake of uptake transporter OATP2B1, and has no induction expression function for intestinal efflux transporter.The efflux of BCRP has a limited effect on ICT absorption, which may be related to the dose concentration of ICT and the saturation concentration of BCRP.

icaritin; intestinal absorption; transport mechanism; Caco-2 cells; LS-180 cells; P-glycolprotein; breast cancer resistance protein; multidrug resistance-associated protein 2; organic anion transporting polypeptides 2B1

R285

A

0253 - 2670(2022)09- 2747 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.018

2021-10-12

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2019-I2M-5-020）

慈小燕（1987—），副研究員，主要從事藥動(dòng)學(xué)及細(xì)胞質(zhì)控研究。Tel: 13622099172 E-mail: cixy@tjipr.com.cn

通信作者：伊秀林（1964—），研究員，主要從事藥動(dòng)學(xué)研究工作。E-mail: yixl@tjipr.com.cn

閆鳳英（1963—），高級(jí)工程師，主要從事生物技術(shù)藥物研究與產(chǎn)業(yè)化工作。E-mail: yanfy@tjipr.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]