基于高光譜成像的大豆葉片葉綠素分布可視化

李勝利

(修武縣農業技術推廣中心， 河南 修武 454350)

0 引言

【研究意義】葉綠素是大豆葉片進行光合作用時吸收利用光能的主要物質，葉綠素含量的高低直接影響大豆葉片光合能力、光合產物積累和最終產量的形成，可以作為大豆養分水平和生長發育狀況的指示器[1-2]。傳統的葉綠素含量測定方法有實驗室試劑法和葉綠素儀測定法，實驗室試劑法一般耗時耗力，且對樣本具有一定的破壞性[3]。葉綠素儀測定法雖測定簡單，但只能測定葉片上某個點的葉綠素相對值[4]。對大豆葉綠素含量進行準確、實時和無損傷監測，以精確掌握大豆養分水平和生長發育狀況，實現大豆生長過程的合理施肥和精準管理意義重大。【前人研究進展】近年來，因高光譜成像技術集合光譜與圖像二者的優勢，同時包含被測物體一維的高光譜反射信息和二維的空間位置信息，高光譜技術與成像技術結合，為高光譜探測目標的圖像分類與定量估測模型的構建與代入提供條件[5-7]。基于高光譜成像技術和不同的圖像分類方法，在煙葉與雜物的分類識別[8]、不同花生品種分類[9]和牧草種類識別[10]等方面獲得較好效果。利用作物的光譜反射特性，孫紅等[11]選用馬鈴薯葉片的高光譜成像數據中382～1 019 nm波段作為研究波段，利用隨機蛙跳算法和偏最小二乘法，選擇敏感波段并構建馬鈴薯葉片葉綠素含量估測模型。丁希斌等[12]采用高光譜成像技術預測了油菜葉片的葉綠素含量，相關系數達0.834。作物生長參數估測模型代入高光譜成像數據實現含量分布可視化方面，前人已經在作物受病害程度、葉片水分含量和葉綠素含量等方面進行研究，通過偽彩色處理技術，對作物生長參數分布具有較直觀的展示[4,13-14]。大豆作為主要的糧油作物，基于光譜分析技術對大豆葉片葉綠素含量的無損監測研究較少。孔維平等[15]利用便攜式葉綠素測定儀和FieldSpec 3地物光譜儀(350～1 000 nm)對大豆葉片葉綠素含量進行估測，且估測模型具有較高的精度和良好的預測能力。宋開山等[16]測定大豆冠層反射光譜和葉綠素數據，使用不同建模方法對葉綠素含量進行估測發現，基于小波分析的回歸模型具有較好的估測效果。【研究切入點】大豆葉片葉綠素含量多數研究是基于便攜式光譜儀采集的數據，并未使用高光譜成像技術采集數據，不能實現大豆葉綠素含量、元素營養水平和生長發育狀況差異性的直觀展示。【擬解決的關鍵問題】選擇葉綠素含量具有代表性的大豆葉片，采集其高光譜成像數據和葉綠素含量值，通過形式簡單、穩定性強和具有生理生化意義的植被指數作為光譜變量構建大豆葉片葉綠素含量估測模型，結合大豆葉片高光譜成像數據，計算高光譜圖像上每一像素點的葉綠素含量值，利用偽彩色圖像處理技術繪制大豆葉片葉綠素含量分布圖，為直觀監測大田的大豆冠層元素營養水平和生長發育狀況提供新的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆品種為黃淮海地區常見品種齊黃34，種子來源于山東省農業科學院。

1.2 大豆栽培與葉片采摘

大豆于2020年6月播種于河南省修武縣農技推廣中心大豆示范中心，按照當地種植習慣進行田間管理，保證大豆樣本與當地正常大豆植株生長水平一致。在大豆初花期和鼓粒期，肉眼觀察大豆葉片葉色和發育程度，采摘葉色和發育程度差異較大的大豆葉片，為避免葉片失水采摘后立即放入冷藏盒中，帶回實驗室進行高光譜圖像信息及葉綠素含量的采集與測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 大豆葉片高光譜圖像信息采集 利用Pika XC高光譜成像系統進行高光譜圖像信息采集，該系統主要由電控位移平臺、高光譜相機、光源、標準白板和計算機等部件組成，結構如圖1所示。高光譜相機的光

圖1 高光譜成像系統

譜分辨率為2.8 nm，采樣間隔為1.6 nm，光譜為400～1 000 nm，通過線性掃描的方式進行高光譜圖像信息采集。首先開啟系統和光源，預熱20 min，以消除基線漂移的影響，調整相機鏡頭與電控位移平臺的垂直距離約為45 cm。然后通過軟件加載高光譜相機與電控位移平臺，調整平臺位置，使鏡頭對準樣本掃描初始位置，進行曝光、暗電流采集、白板校正和圖像寬高比調節等工作。最后對大豆葉片進行高光譜成像數據采集，每次采集完成后均需重新進行標準白板校正，利用公式(1)計算大豆葉片的高光譜成像數據。

(1)

式中，Iraw為樣本葉片未經校正的高光譜數據，Iwhite為白板數據，Idark為暗電流數據，R為校正過后的大豆葉片高光譜成像數據。

1.3.2 大豆葉片葉綠素含量 大豆葉片葉綠素含量測定參考張憲政[17]的方法，大豆葉片高光譜成像數據采集完成后，立即使用直徑為1.5 cm的打孔器在主葉脈兩側兩孔并稱量孔重，剪為細絲狀后放入20 mL 80%丙酮溶液中，在20℃下黑暗浸提1 d，直至大豆葉片葉色完全變白，測定溶液在663 nm和645 nm處的光密度，利用計算公式(2)和(3)計算的葉綠素含量作為該大豆葉片樣本的葉綠素含量。

Chlt=20.21A645+8.02A663

(2)

(3)

式中，A663和A645分別表示波長663 nm和645 nm的吸光度，Chlt表示葉綠素濃度(mg/L)，C表示葉綠素質量濃度(mg/L)，V表示提取液的體積(mL)，W表示葉片重(g)，LCC(mg/L)表示葉片葉綠素濃度。

1.4 數據處理

1.4.1 訓練集與預測集的選擇 采用濃度梯度法[18]在大豆葉片總樣本中，按葉綠素含量高低順序排列，每隔3個樣本抽取1個大豆葉片樣本作為預測集，剩余大豆葉片樣本作為訓練集。

1.4.2 大豆葉片高光譜反射率的獲取 大豆葉片樣本進行高光譜成像數據采集完成后，在ENVI 5.3中以整張大豆葉片作為感興趣區域(Region Of Interest，ROI)，對ROI上每一像素點上的反射光譜進行平均處理，作為該大豆葉片樣本的反射光譜。

1.4.3 植被指數 植被指數作物高光譜遙感估測模型中最常用的光譜參量，其特質為形式簡單、穩定性強和具有一定的生理生化意義。如表1所示，一是引用前人研究中與葉綠素含量相關性較強的植被指數；二是構建400～1 000 nm內各波段光譜反射率兩兩自由組合的差值植被指數(Difference Vegetation Index，DVI)、比值植被指數(Ratio Vegetation Index，RVI)和歸一化植被指數

表1 植被指數的計算公式

(Normalized Difference Vegetation Index，NDVI)，計算構建的自由組合植被指數與葉綠素含量的相關性，通過二者相關性的強弱確定所需要的自由組合植被指數。3種自由組合植被指數的計算公式如下：

DVI(i,j)=Ri+Rj

(4)

(5)

(6)

式中，R表示原始光譜反射率或一階導數光譜值，i和j表示波長(nm)，Ri和Rj表示在波長i或j波長的原始光譜反射率或一階導數光譜值。

1.4.4 估測模型的構建與檢驗 通過訓練集樣本數據構建大豆葉片葉綠素含量估測模型，并利用預測集樣本數據對估測模型進行精度評價。通過引用前人植被指數(表1)與自由組合植被指數分別和葉綠素含量進行相關性分析，根據相關性的大小參與葉綠素含量估測模型的構建，主要以線性和二次回歸方程對植被指數和葉綠素含量進行擬合，擬合方程如下：

線性函數：y=αx+b

二次函數：y=αx2+bx+c

對估測模型優劣的評價指標主要有決定系數R2(Determination Coefficients)和均方根誤差RMSE(Root Mean Square Errors)，其中訓練集和預測集的決定系數分別為R2c和R2p。R2的值介于0～1，當R2的值越接近1且RMSE越接近0時，表明模型的預測效果越佳，精度越高。R2和RMSE計算公式如下：

(7)

(8)

式中，yi代表預測值，yj代表實測值，n代表樣本數。

1.4.5 大豆葉片葉綠素含量可視化分布 大豆葉片葉綠素含量分布可視化的原理是利用高光譜成像數據和含量估測模型實現葉綠素含量在對應空間位置的數字化顯示，主要包括目標樣本圖像分割和含量可視化兩部分。

1) 目標對象圖像分割。目標樣本圖像分割是將高光譜成像數據中大豆葉片與背景的光譜信息與空間信息進行分割，獲得只包含大豆葉片的信息。在ENVI 5.3中利用支持向量機技術，以大豆葉片與背景的光譜特征不同作為支持向量機技術的分類標準，輸出二者的分類結果，然后通過矢量變換和掩模等步驟輸出只包含大豆葉片的高光譜成像數據。

2) 含量可視化。通過大豆葉片葉綠素含量估測模型和高光譜成像數據，計算大豆葉片高光譜圖像上每個像素點的葉綠素含量值，此時大豆葉片高光譜圖像變換為含位置信息的葉綠素含量分布灰度圖，按灰度圖各位置的灰度值進行偽彩色處理，最終獲得葉綠素在大豆葉片上的含量可視化分布圖。

2 結果與分析

2.1 訓練集與預測集的葉綠素含量分布

由表2可見，訓練集和預測集中大豆葉片的葉綠素平均含量分別為2.513 mg/g和 2.591 mg/g，變異系數分別為31.8%和30.6%。

表2 訓練集與預測集的葉綠素含量分布

2.2 大豆葉片反射光譜曲線

由圖2可見，由于葉綠素的強反射作用，在540 nm左右的綠光范圍形成“綠峰”；葉綠素對670 nm左右的紅光具有強吸收作用，形成“紅谷”；葉綠素對紅光強吸收和葉片復雜結構對近紅外光的多次強反射，導致在波長680～760 nm內產生1條反射率急劇上升的斜邊，稱為紅邊。大豆葉片反射光譜中的綠峰、紅谷和高反射率平臺的反射率值和紅邊的波段位置差異顯著，表明選擇的訓練集樣本具有良好的代表性，可以進行大豆葉片葉綠素含量的高光譜估測研究。

圖2 大豆樣本葉片的反射光譜曲線

大豆葉片樣本按葉綠素含量(0.919～4.125 mg/g)的高低順序分為4組:0.919～1.720 mg/g、1.720～2.522 mg/g、2.522～3.323 mg/g和3.323～4.125 mg/g，進行平均處理獲得不同葉綠素含量的大豆葉片反射光譜曲線(圖3)，隨著大豆葉片葉綠素含量的增加，“綠峰”反射率值下降明顯，680～760 nm的紅邊位置明顯向長波方向移動，但高反射率平臺的反射率無顯著變化規律。

圖3 不同含量葉綠素的大豆葉片反射光譜曲線

2.3 大豆葉片葉綠素含量與反射光譜的關系

2.3.1 與反射光譜的相關性 如圖4所示，葉綠素含量與光譜反射率在各波段的相關性大小和顯著性不同，在400～424 nm和743～1 000 nm呈正相關，與425～742 nm呈負相關，二者在474～734 nm呈顯著負相關水平(P<0.05)，在486～731 nm呈極顯著負相關水平(P<0.01)，相關性最強的波段位于700 nm(r=-0.879)。

圖4 大豆葉片光譜反射率與葉綠素含量的相關性

2.3.2 與植被指數的相關性 如圖5所示，400～1 000 nm波段自由組合形成的DVI、RVI和NDVI與葉綠素含量間的相關系數具有沿對角線對稱分布的特點；3種自由組合形成的植被指數與葉綠素含量相關性強的光譜波段主要在490～760 nm的可見光區域，尤其分布在綠光(492～577 nm)和紅光(622～760 nm)范圍內。

注：每個像素點的色度值代表構建的植被指數與大豆葉片葉綠素含量相關系數的大小。

如表3所示，現葉綠素含量與植被指數的相關性均達極顯著水平(P<0.01)，引用的植被指數中PSRI與葉綠素含量的相關性最差(r=0.336)，m NDI與葉綠素含量的相關性最優(r=0.905)，3種自由組合植被指數與葉綠素含量的相關系數均在0.9以上，其中RVI (968,698)與葉綠素含量的相關性最好(r=0.923)。

表3 大豆葉片葉綠素含量與植被指數的相關性

2.4 大豆葉片葉綠素含量估測模型的構建與檢驗

表4 基于植被指數的大豆葉綠素含量估測模型

2.5 大豆葉片葉綠素含量的可視化

如圖6所示，葉綠素含量由下向上逐漸上升；由大豆葉片上不同顏色可知，成熟健康的大豆葉片中，葉綠素主要分布在葉脈兩側，葉綠素含量較高，在葉片邊緣和基部葉綠素含量較低，在衰老或損傷的葉片中，葉綠素主要集中在葉片未失綠的位置，在葉片失綠的位置含量較低。表明，基于高光譜成像技術的大豆葉片葉綠素含量可視化的分布情況符合事實規律，大豆葉片葉綠素含量分布可視化效果較好。

注：A為大豆葉片高光譜圖像，B為大豆葉片與背景分割圖像，C為大豆葉片葉綠素含量分布可視化圖像；右側色度條中不同顏色對應不同的葉綠素含量，隨著數值增大色度條顏色由藍色漸變為紅色。

3 討論

作物葉片反射光譜特征包括藍谷、紅谷、綠峰、高反射率平臺、紅邊和紅邊位置等，主要受到葉片葉綠素含量、水分含量和葉片結構等因素綜合影響[24-25]。該研究中隨著大豆葉片葉綠素含量的增加，“綠峰”反射率明顯下降，紅邊位置發生“紅移”，表明葉綠素對可見光具有強吸收作用，高反射率平臺反射率并沒有發生明顯有規律的變化，高反射率平臺的差異主要與葉片細胞結構、葉片厚度和內部組織有關，表明葉片葉綠素含量與葉片結構之間沒有明顯聯系[26-29]。該研究中直接對原始光譜反射率和葉綠素含量進行相關性分析，并未對原始反射光譜進行預處理變換，前人研究表明，對原始反射光譜進行預處理變換，如一階導數變換、連續小波變換、標準正太變量變換和移動平均法等光譜預處理方法，可以減弱外界因素的干擾并增強光譜反射特征[30-31]。

大豆葉片葉綠素含量與植被指數相關性分析發現，葉綠素含量與波段反射率自由組合植被指數的相關性優于引用的前人植被指數[19-23]，可能因為植被指數具有明顯的時效性和空間差異性，受環境、作物種類和觀測尺度等因素影響，所以基于自身反射光譜數據構建的植被指數與葉綠素含量的相關性更強[32]。該研究采用植被指數作為光譜參量通過線性和二次方程構建葉綠素含量估測模型表明，其他光譜參量如光譜面積和紅邊位置等，與作物農學參數含量、生理參數和產量品質之間同樣具有較強的相關性，紅邊位置的“紅移”和“藍移”也常用作估測作物的氮素營養水平[33-34]。另有研究表明，采用逐步回歸、偏最小二乘和神經網絡等建模方法的建模效果優于簡單的線性和二次方程建模方法[35-36]。

該研究中，基于大豆葉片高光譜圖像和葉綠素含量估測模型，基本實現葉綠素在大豆葉片上含量可視化分布，可以較為直觀的反映葉綠素在大豆葉片分布情況。在葉片某些區域葉綠素含量的可視化分布情況不合理，這主要由于大豆葉片表面不平整，造成葉片不同位置距離鏡頭的距離不一致，當光源照射后，這些位置存在模糊、過曝和陰影等問題，導致不同位置的光譜反射率有差異或失真。另外，大豆葉片不同位置的內部結構和化學成分不同，可在對應的反射光譜中體現，因而通過估測模型預測的葉綠素含量具有差異。該研究是在葉片觀測水平對大豆進行葉綠素含量的進行可視化研究，雖在較高的冠層尺度、無人機尺度和衛星尺度的觀測尺度下的大豆葉綠素含量可視化研究更具有實際意義，但葉片尺度上的可視化研究可為其他尺度的研究提供方法和思路。后續還需在其他生態點、更多品種和不同尺度進行試驗，利用多種光譜變量和建模方法完善改進大豆葉片葉綠素含量估測模型，以期提高預測精度、增強普適性和實現跨尺度葉綠素含量估測。對基于高光譜成像數據的大豆葉片葉綠素含量分布可視化的步驟進一步優化，實現效果更優的葉綠素含量分布可視化視覺表達。

4 結論