烤煙感病苗與健康苗根圍基質微生物群落結構及其多樣性

劉亭亭， 李文紅， 汪漢成， 蔡劉體， 張長青， 穆 青

(1.長江大學 農學院， 湖北 荊州 434025； 2.貴州省植物保護研究所， 貴州 貴陽 550006； 3.貴州省煙草科學研究院， 貴州 貴陽 550081； 4.貴州省煙草公司 黔西南州公司， 貴州 興義 562400)

0 引言

【研究意義】煙草是我國主要的經濟作物之一，在我國云南、貴州、四川、湖南、湖北等省均有種植[1]，集約化育苗是我國煙草的主要育苗方式，以漂浮育苗和托盤育苗為主[2]。在環(huán)境條件適宜時，基質土壤中的病原菌侵染煙苗導致發(fā)病，煙苗罹病后其煙苗各部位微生物群落結構與多樣性改變，因此，了解煙苗患感病前后微生物群落的變化情況，對煙草苗期病害的防控具有重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M展】在育苗期我國大部分煙草種植區(qū)長期低溫寡照、多陰雨，導致苗床滋生多種病害，其中報道較多的病害有煙草猝倒病[3-5]、煙草立枯病[6]、煙草黑脛病[7]、煙草枯萎病[8]、煙草灰霉病[9]等。大部分苗期病害為根莖性病害，其病原菌來源于育苗基質、漂盤、煙草種子、育苗用水等育苗物資或環(huán)境，其中育苗基質為主要來源。關于苗期基質病原菌的檢測雖有報道，但主要集中在單個病原菌的檢測上[10]。隨著高通量測序技術的發(fā)展，不同生境下的微生物群落結構被逐漸認知，包括煙草根圍[11-12]、大田期煙葉葉際[13]、種子[14]及烘烤期煙葉葉際[15-16]的微生物?！狙芯壳腥朦c】關于苗期煙株患感病前后根圍基質的微生物群落結構與多樣性變化卻鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】因此，采用高通量測序技術對烤煙苗期患感病及健康煙苗根圍基質進行微生物群落結構及多樣性分析，旨在揭示煙苗患感病前后微生物群落的變化情況，為指導煙草苗期病害的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙草 供試煙草品種為云煙87，是貴州省主栽烤煙品種。該品種于2021年2月15日播種于貴州省興義市煙草育苗工廠，煙株田間管理按照標準化生產方式進行管理。

1.1.2 主要試劑 基質基因組DNA提取試劑盒購，購自天根生化科技有限公司；GeneJET膠回收試劑盒和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒，均購自Thermo Scientific公司。

1.2 樣品采集

2021年4月在貴州省興義市煙草基地進行樣品采集。隨機選取5株感病煙苗(莖基部有褐色病斑且邊緣明顯，受害部有干枯縊縮的現象)和5株健康煙苗，將煙苗整株拔起，輕輕抖落并收集須根周圍的基質，兩組樣品分別編號JZT(感病)和JZCK(健康)感病樣品依次編號為JZT1、JZT2、JZT3、JZT4和JZT5，健康樣品依次編號為JZCK1、JZCK2、JZCK3、JZCK4和JZCK5。樣品收集后放入低溫保存箱，并迅速帶回實驗室放置于-80℃超低溫冰箱保存，備用。

1.3 感病煙苗與健康煙苗根圍基質微生物群落結構及多樣性分析

采用基質基因組DNA提取試劑盒進行基質微生物基因組DNA的提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA的質量。將提取的DNA置于離心管中，并用無菌水稀釋至濃度為1 ng/μL，以此為模板，使用引物ITS1-5F-F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS1-1F-R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)、515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)分別對基質真菌ITS1區(qū)域與細菌V4區(qū)域進行擴增。PCR擴增體系：Phusion?高保真酶(New England Biolabs)15 μL，上游、下游引物各0.2 μmol/L，模板DNA 10 ng。PCR擴增程序：98℃預變性1 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測，使用GeneJET膠回收試劑盒回收純化產物，之后將擴增產物送至北京諾禾致源科技股份有限公司，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒構建文庫，文庫經Qubit定量和文庫檢測合格后在Thermofisher的Ion S5TMXL進行上機測序。

1.4 數據處理

參照劉暢等[13，17]的方法對后續(xù)數據進行分析，包括樣品的Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析(PCA分析[18]、ANOSIM分析)、物種組成、功能預測分析等，此過程均在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 測序深度

如圖1所示，在序列數達到30 000個時，所有樣品的稀釋曲線開始趨于平緩。當序列數達到40 000個時，稀釋曲線已趨于飽和，表明此次測序深度已經覆蓋樣品絕大多數物種，足以反映樣品的物種多樣性。

圖1 感病煙苗與健康煙苗根圍基質細菌(A)和真菌(B)擴增子測序稀釋曲線

2.2 數據質控

通過對Reads剪切過濾，對于細菌群落來說，平均每個樣品測得82 091條原始數據，經過質控平均得到77 890條有效數據，質控有效率達95.2%。通過與數據庫Silva132比對，進行物種注釋，并對不同分類層級統(tǒng)計發(fā)現：共有2 057個OTUs，其中，能夠注釋到數據庫的OTUs數目為2 057個(100.0%)，注釋到界、門、綱、目、科、屬和種水平的比例分別為100.0%、96.3%、91.5%、81.8%、72.6%、51.5%和11.4%。對于真菌群落，平均每樣品測得74 614條reads，經過質控平均得到72 881條有效數據，質控有效率達97.7%。通過與數據庫UNITE比對發(fā)現：共有998個OTUs，其中，能夠注釋到數據庫的OTUs數目為927(92.9%)，注釋到界、門、綱、目、科、屬和種水平的比例分別為92.9%、44.3%、37.3%、36.1%、32.2%、28.2%和17.5%。

2.3 感病苗與健康苗根圍基質微生物群落Alpha多樣性

如表1所示，根圍基質微生物群落的覆蓋度指數為0.996～0.998，表明本次測序的數據合理，能真實、合理地反映微生物群落的多樣性。健康苗根圍基質(JZCK)微生物群落的Alpha多樣性指數(Shannon、Chao1、ACE指數)均高于感病苗根圍基質(JZT)，經LSD檢測感病苗與健康苗根圍基質的細菌與真菌群落的Alpha多樣性指數間均無顯著性差異。

表1 感病煙苗與健康煙苗根圍基質微生物Alpha多樣性指數(種水平)

2.4 感病煙苗與健康煙苗根圍基質微生物群落特征

由圖2可見，在門水平，所有樣品的細菌主要分布在變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，其中，JZT的變形菌門相對豐度顯著高于JZCK，JZCK的擬桿菌門相對豐度顯著高于JZT。在屬水平，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質相對豐度排名前10的優(yōu)勢屬(相對豐度>1%)為未分類的藍細菌(unidentified Cyanobacteria)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘脂單胞菌屬(Sphingopyxis)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、柄桿菌屬(Caulobacter)、羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、Pseudolabrys、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)和Reyranella，其中JZCK的地桿菌屬(Pedobacter)和Terrimons相對豐度顯著高于JZT。感病煙苗根圍基質(JZT)特有的優(yōu)勢細菌屬(>1%)為Dongia、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和纖維菌屬(Cellulomonas)，健康煙苗根圍基質(JZCK)特有的優(yōu)勢細菌屬(>1%)為Terrimonas、地桿菌屬(Pedobacter)和Romboutsia。原始測序數據均上傳至GenBank(BioProject ID：PRJNA752815；Biosample accession：SUB10169531)。

注：表示感病與健康煙苗基質微生物在P<0.05水平的差異顯著性。下同。

由圖3A可見，在門水平，所有樣品的真菌主要分布于子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和隱真菌門(Rozellomycota)，其中JZT2中的擔子菌門相對豐度遠高于其他樣品。由圖3B可見，在屬水平，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質均有的優(yōu)勢屬(豐度>1%)為金孢子菌屬(Chrysosporium)和假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)，其中JZCK的Psiloglonium相對豐度顯著高于JZT。感病煙苗根圍基質(JZT)特有的優(yōu)勢屬為錐毛殼屬(Coniochaeta)、螺菌屬(Neobulgaria)、絲衣霉屬(Byssochlamys)、曲霉屬(Aspergillus)和Pseudeurotium，其中JZT2的亡革菌屬(Thanatephorus)的相對豐度可達91.9%，亡革菌屬屬于擔子菌門，健康煙苗根圍基質(JZCK)特有的優(yōu)勢真菌屬(>1%)為節(jié)叢孢屬(Arthrobotrys)。原始測序數據均上傳至GenBank(BioProject ID：PRJNA752729；Biosample accession：SUB10

圖3 感病與健康煙苗根圍基質中真菌在門(A)、屬(B)水平的群落組成

2.5 感病與健康煙苗根圍基質微生物群落結構差異

如圖4所示，經PCA分析，在細菌群落方面，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質細菌分布相對緊密，表明感病(JZT)與健康(JZCK)樣品的微生物群落結構相似，PC1和PC2對群落結構的貢獻值分別為26.38%和15.96%。在真菌群落方面，感病(JZT)與健康(JZCK)分布相對分散，表明罹病(JZT)與健康(JZCK)樣品的微生物群落結構差異較大，PC1和PC2群落結構的貢獻值分別為20.09%和17.2%。

圖4 罹病與健康煙苗根圍基質細菌(A)和真菌(B)的PCA分析

2.6 真菌與細菌群落差異

如圖5所示，真菌與細菌群落的R值均大于0，說明組內差異小于組間差異。在細菌群落中，P值大于0.05，JZCK與JZT間無顯著差異；在真菌群落中，P值小于0.05，表明JZCK與JZT分組間存在顯著性差異。

圖5 感病與健康煙苗根圍基質中細菌(A)和真菌(B)的ANOSIM分析

2.7 代謝功能

如圖6A所示，感病與健康煙苗根圍基質中細菌在一級代謝功能層主要分布于6類代謝通路：代謝類(Metabolism)、環(huán)境信息處理類(Environmental information processing)、遺傳信息處理類(Genetic information processing)、細胞過程類(Cellular processes)、人類疾病類(Human diseases)和有機系統(tǒng)類(Organismal systems)，其中代謝類在感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質細菌群落中相對豐度最高，其次為環(huán)境信息處理類和遺傳信息處理類，有機系統(tǒng)類豐度最低。

在二級代謝功能層上(圖6B)，整體來說，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質細菌主要分布于35類代謝通路，其中兩者分布于新陳代謝類的細菌種類最多，功能從強到弱(>1%)的依次為氨基酸代謝(Amino acid metabolism，10.5%～11.0%)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism，9.8%～10.3%)、能量代謝(Energy metabolism，5.1%～6.1%)、異生素代謝和降解(Xenobiotics biodegradation and metabolism，3.7%～4.6%)、輔酶和維生素代謝(Metabolism of cofactors and vitamins，3.9%～4.3%)、脂質代謝(Lipid metabolism，3.6%～4.0%)、核苷酸代謝(Nucleotide metabolism，2.9%～3.3%)、代謝(Metabolism，2.4%～2.5%)、萜類化合物和聚酮化合物代謝(Metabolism of terpenoids and polyketides，2.0%～2.2%)、其他氨基酸代謝(Metabolism of other amino acids，2.0%～2.2%)、酶家族(Enzyme families，1.6%～1.9%)和聚糖生物合成和代謝(Glycan biosynthesis and metabolism，1.6%～1.8%)。

注：A, L1水平的KEGG功能相對豐度。B, L2水平的KEGG功能聚類熱圖。C, FUNGuild功能相對豐度。

苗期基質真菌經FUNGuild功能預測分析(圖6C)，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質真菌主要分布于25個生態(tài)功能群，不同樣品之間功能組成相似，但優(yōu)勢功能群所占比例有所差異。健康煙苗根圍基質(JZCK)中未定義腐生菌(Undefined saprotroph，7.1%)相對豐度最高，其次為未定義腐生-木腐生菌(Undefined saprotroph-wood saprotroph，3.4%)和動物病原-基質腐生菌(Animal pathogen-substrate saprotroph，1.1%)。感病煙苗根圍基質(JZT)中植物病原菌(Plant pathogen，19.2%)相對豐度最高，其次為未定義腐生菌(Undefined saprotroph，12.4%)、未定義腐生-木腐生菌(Undefined saprotroph-wood saprotroph，8.8%)、動物病原-糞腐生-內生-植物病原-未定義腐生菌(Animal pathogen-dung saprotroph-endophyte-plant pathogen-undefined saprotroph，5.8%)和動物病原-基質腐生菌(Animal pathogen-substrate saprotroph，2.4%)。

3 討論

在物種組成上，感病與健康煙苗根圍基質微生物的組成和豐度具有明顯差異。在細菌群落方面，在門水平上，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗基質優(yōu)勢細菌門為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，與向立剛等[12]對健康與感染黑脛病煙株根際基質細菌群落研究的優(yōu)勢細菌門結果類似。感病后，變形菌門豐度顯著上升，變形菌門中包含大量的動植物病原菌[19]，其相對豐度的顯著升高，可能引起植株的抗逆性減弱，發(fā)病率上升的情況。在屬水平上，感病與健康煙苗基質優(yōu)勢細菌屬均為未分類的藍細菌、德沃斯氏菌屬、假單胞菌屬等，與向立剛等[12]對健康與感染黑脛病煙株根際基質細菌群落研究的優(yōu)勢細菌屬結果差異較大，可能原因是兩者取樣基質來源不同引起。感病煙苗根圍基質中德沃斯氏菌屬和假單胞菌屬豐度分別高出2.3%和1.6%。德沃斯氏菌屬為固氮共生菌[20]，假單胞菌屬的Pseudomonassyringaepv.tabaci和Pseudomonassyringaepv.angulata分別為煙草野火病和細菌性角斑病的致病菌[7]，苗期基質發(fā)現的假單胞菌屬中是否含有上述2種煙草致病菌有待進一步研究。在真菌群落方面，在門水平上，感病與健康煙苗基質優(yōu)勢真菌門為子囊菌門、擔子菌門和羅茲菌門，與向立剛等[11]黑脛病感染對根際基質真菌群落研究的優(yōu)勢菌門基本一致。在屬水平上，感病煙苗根圍基質金孢子屬與假裸囊菌屬明顯偏高，金孢子屬為基質常見的腐生真菌[21]，推測煙苗發(fā)病后，其生長環(huán)境和營養(yǎng)條件適宜菌群定殖及生長。此外，在感病煙苗根圍基質上發(fā)現了特有的優(yōu)勢真菌曲霉屬和亡革菌屬(JZT2中占比達91.9%)，曲霉屬為基質和土壤中廣泛存在的腐生菌，亡革菌屬的Thanatephoruscucumeris為苗期煙草立枯病的病原菌，推測該研究取樣的感病煙苗中可能存在感立枯病的煙苗，同時煙苗發(fā)病后，環(huán)境中的曲霉菌在罹病組織上獲得繁殖。基于16s RNA和ITS的高通量測序技術能夠較好的分析育苗基質中的細菌和真菌群落結構與多樣性，然而，該技術不能擴增包括煙草腐霉、黑脛病菌在內的多種卵菌病原菌。為此，針對煙草育苗期常出現的卵菌病害，下一步有待采用卵菌選擇性培養(yǎng)基或開發(fā)基于高通量測序的卵菌群落結構分析技術進行苗期卵菌病害的檢測。

高通量測序技術既可揭示苗期微生物的群落結構，同時也可根據獲得微生物的相對豐度對其環(huán)境微生物的功能進行預測。該研究發(fā)現，感病與健康煙苗根圍細菌主要分布于代謝類，據報道寡養(yǎng)單胞菌屬可以產生生長激素，促進根的生長發(fā)育[22]，德沃斯氏菌屬和柄桿菌屬可以進行固氮作用[20,23]，含鞘氨醇盒菌可以促進基質的降解[24]。這可能與苗期基質含腐熟或未腐熟的營養(yǎng)物質有關，需要通過細菌的降解轉化為煙苗生長能利用的營養(yǎng)物質。真菌FUNGuild預測發(fā)現，感病與健康煙苗根圍基質中均含有大量的腐生菌，腐生菌為基質中的常見菌屬，結果與李朋發(fā)等[25]的研究結果一致。

4 結論

采用第二代高通量測序技術對感病與健康煙苗根圍基質微生物群落結構及多樣性分析發(fā)現，根圍基質微生物群落結構復雜，其類群組成與煙苗感病與否密切相關。健康煙苗根圍基質真菌和細菌的Alpha多樣性指數均高于感病煙苗根圍基質；感病基質的植物病原菌類群較健康基質多。