核受體結合SET域蛋白1催化活性區域B細胞優勢表位的預測與分析

陳旭東

組蛋白賴氨酸甲基化酶（HMTases）可以催化組蛋白的甲基化，參與多種生物學事件，對DNA復制、DNA損傷應激、細胞周期循環、胞質分離及轉錄調節等多方面有重要作用[1]。HMTases可以特異性地將甲基從s-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）轉移到組蛋白末端的幾個特定的賴氨酸[2]。核受體結合SET域蛋白家族（NSDs）是HMTases中的一支亞家族，包括NSD1、NSD2（MMSET/WHSC1）和NSD3（WHSC1L1），都包含具有催化活性的SET結構域，該結構域高度保守[3]。NSD1、NSD2及NSD3在小鼠發育中是必須的，敲除NSD1及NSD2的基因會導致小鼠死亡[4]。研究表明，NSDs的突變和擴增與多種發育異常疾病和腫瘤相關[5-6]。NSD1的SET結構域可以特異性地催化H3K36[7]。NSD1的異常表達及活性改變和多種腫瘤有關。現已有多項研究以甲基化酶為靶標，開發抑制藥物，以期待治療相應的疾病[8-9]。本研究擬預測NSD1催化活性區域（NSD1-CD）的B細胞優勢表位，來為應用多肽小片段制備單克隆抗體、表位疫苗及研究其蛋白功能提供重要的依據。報道如下。

1 資料與方法

1.1 NSD1-CD段氨基酸序列的獲取 NSD1全長氨基酸序列檢索于uniProt蛋白質數據庫（http://www.uniprot.org/），NSD1-CD段的范圍參考Qiao等[10]研究。

1.2 NSD1-CD蛋白的二級結構獲取 自PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）獲取NSD1-CD（PDB ID 300I）的三級結構，使用蛋白質二級結構詞典DSSP（Definition of Secondary Structure of Proteins，DSSP）獲取其二級結構。

1.3 NSD1-CD蛋白親水性、極性、抗原性和表面可及性的預測 利用EXPASY服務器提供的親水性參數（Hopp&Woods）、極性參數（Zimmerman）和DNAstar軟件的Protein進行的表面可及性參數（Emini）、抗原性參數（Jameson-Wolf）和柔韌性參數（Karplus-Schulz）方法來對NSD1-CD蛋白B細胞表位進行預測。

1.4 綜合分析 綜合以上預測方法，兼顧各項預測參數推斷NSD1蛋白B細胞表位，采用吳玉章等[11]建立的抗原性指數（AI）綜合評判NSD1-CD B細胞表位的優勢區域。

1.5 結合蛋白質三級結構分析 在PYMOL軟件上標出優勢表位在NSD1-CD上的位置，在uniProt蛋白質數據庫網站上通過Structure模塊的Toggle controls panel工具進行測距。

2 結果

2.1 NSD1-CD的氨基酸序列 NSD1全長為2 696個氨基酸（長型），相對分子質量為296.65 kDa。NSD1-CD的范圍是1 852～2 082，其中包含3個結構域：PRE-SET（AWS）1 890～1 940，SET 1 942～2 059，POST-SET 2 066～2 082；長為231個氨基酸，相對分子質量為26.53 kDa，具體序列如下：KELRQLQEDRKNDKKPPPYKHIKVNRPIGRVQIFTADLSEIPRCNCKATDENPCGIDSECINRMLLYECHPTVCPAGGRCQNQCFSKRQYPEVEIFRTLQRGWGLRTKTDIKKGEFVNEYVGELIDEEECRARIRYAQEHDITNFYMLTLDKDRIIDAGPKGNYARFMNHCCQPNCETQKWSVNGDTRVGLFALSDIKAGTELTFNYNLECLGNGKTVCKCGAPNCSGFLG。

2.2 NSD1-CD的二級結構 自PDB獲取NSD1-CD的三級結構，使用蛋白質二級結構詞典DSSP獲取其二級結構，提示NSD1-CD蛋白的二級結構中以無規卷曲為主-螺旋、-轉角相對較少。可見無規則卷曲主要位于NSD1全長N端的1 865～1 870、1 879～1 887、1 893～1 910、1 917～1 926、1 940～1 943、1 949～1 953、1 959～1 966、1 992～1 997、2 022～2 026、2 045～2054及2 057～2082。見封二彩圖1和表1。

表1 NSD1-CD的二級結構的構成比 例（%）

2.3 多參數預測NSD1-CD蛋白表位 按照Hopp＆ Woods、Zimmerman、Jameson-Wolf、Karplus-Schulz及Emini方案分別預測NSD1-CD蛋白的親水性、極性、抗原性、柔韌性和表面可及性。其中高于閾值的肽段即為預測的抗原表位（抗原指數≥0，親水性指數≥0，表面可及性指數≥1，極性指數≥12）。綜合分析NSD1-CD的親水性、極性、柔韌性、表面可及性和抗原性顯示：應用不同參數預測的B細胞抗原表位肽段略有差異，但位于N端的1 856～1 870，1 900～1 902，1 938～1 942，1 957～1 964在多種預測方法中一致。見封二彩圖2和表2。

表2 NSD1-CD親水性、極性、柔韌性、抗原性、表面可及性等參數的預測結果

2.4 NSD1-CD蛋白表位的綜合預測 綜合以上預測方法及AI計算方法，計算NSD1-CD的B細胞表位平均AI，結果顯示人NSD1-CD的1 865～1 869、1 959～1 964平均AI較高，提示其可能為B細胞表位的優勢區域。見表3。

表3 NSD1-CD B細胞表位的平均抗原性指數

2.5 結合蛋白質三級結構分析 自PDB獲取NSD1-CD（PDB ID 300I）的三級結構文件，通過PYMOL標記出SET結構域和優勢表位的位置，可見SET結構域形成了一個“口袋”狀結構，口袋中即為其活性區域，內側可容納一個AdoMet，可催化其轉移甲基至組蛋白上。優勢表位KTDIKK（1 959～1 964）位于SET結構域上，但位于“口袋”的外側底部，距離活性區域較遠（封二彩圖3a）。而優勢表位KKPPP（1 865～1 869）位于PRE-SET（AWS）上，在“口袋”的“口”附近（封二彩圖3b）。在uniProt蛋白質數據庫網站上通過Structure模塊的Toggle controls panel工具進行測距，測量1 961號天冬氨酸（位于優勢表位KTDIKK的中央）和AdoMet的距離，結果為24.22?（封二彩圖4a），測量1 867號脯氨酸（位于優勢表位KKPPP的中央）和AdoMet的距離，結果為13.25?（封二彩圖4b）。

3 討論

使用生物信息學預測B細胞表位是現如今廣泛使用且高效方便的方法[12-13]，目前有多種B細胞表位的預測方法，但由于各種方法的差異性及局限性，不同方法預測的表位差異較大，故研究人員正不斷地改進與完善預測評價體系，使B細胞表位的預測、評價標準化。目前得到公認的具有較好預測結果的方法有二級結構、親水性、抗原性、表面可及性等參數的預測，本研究將以上參數與吳玉章等[11]建立的AI相結合，從而初步地做出科學、合理的預測分析。

由于NSD-1蛋白的甲基轉移活性主要是通過SET結構域實現的，本研究通過截取其中的一部分（NSD-CD），包括包含三個結構域（PRE-SET 1 890～1940，SET1 942～2 059，POST-SET2066～2082），從而減少預測的難度。用多種方法對其B細胞表位進行預測，最終得到了2段優勢B細胞表位，分別位于N端的1 865～1 869及1 959～1 964，其中優勢表位KTDIKK（1 959～1 964）位于SET結構域上，但是距離AdoMet所在的活性區域較遠，1 961號天冬氨酸（位于優勢表位KTDIKK的中央）和Ado-Met的距離為24.22?，影響其活性的可能性較小；而優勢表位KKPPP（1 865～1 869）位于PRE-SET（AWS）上，且距離AdoMet所在的活性區域較近，在uniProt蛋白質數據庫網站上通過Structure模塊的Toggle controls panel工具進行測距，測量1 867號脯氨酸（位于優勢表位KKPPP的中央）和AdoMet的距離，結果為13.25?，對SET結構域的甲基轉移活性有影響的可能性較大。

在Qiao等[10]的研究中，POST-SET結構域如同一個“蓋子”，覆蓋在SET結構域的活性區域表面，被認為對其活性有重要作用，具有作為藥物靶點的可能。但本研究顯示POST-SET段親水性及表面可及性較弱，難以預測出優勢B細胞表位。本研究成功預測了NSD1的B細胞優勢表位，為應用多肽小片段制備單克隆抗體、表位疫苗及研究其蛋白功能提供重要的依據。