針刀對中晚期膝骨關節炎兔軟骨下骨重塑的影響*

劉 聰 郭 妍 秦露雪 王軍美 尹孟庭 郭長青△

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫醫院，北京 100010）

膝骨關節炎（KOA）是一種以關節軟骨退變、軟骨下骨硬化伴骨贅形成及滑膜增生為主要病理改變，以關節疼痛、僵硬和功能障礙為主要臨床表現的慢性退行性全關節病變[1]，是導致老齡化人口疼痛和殘疾的主要原因，患者生活質量受到嚴重影響，為家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。

在導致KOA的眾多原因中，關節軟骨的退化或喪失一直以來被認為是主要原因，但學者Radin首次提出，在軟骨退變的開始和進展過程中軟骨下骨起著重要作用，越來越多證據證明了這一觀點，甚至有學者認為軟骨下骨異常重塑可能是KOA發病的始動因素[2-3]。雖然迄今為止仍未能明確直接導致KOA的原因，但軟骨下骨作為一個新的研究熱點，其重要性已得到公認。在膝關節中，軟骨下骨為軟骨提供機械支撐，并與其他關節組織共同維護關節軟骨的穩態和完整性[4]，但在異常機械應力的作用下，軟骨下骨發生異常骨重塑，主要表現為KOA早期骨吸收，中晚期骨形成[5]，這些變化均導致軟骨下骨剛度發生改變，其合理分配負荷的能力降低，導致上覆關節軟骨的應力增加，進而誘發軟骨退變并進一步導致KOA。

近年來針刀療法在治療KOA中得到了廣泛應用，并取得了較好的緩解癥狀和改善關節功能的效果。本團隊前期研究也證明了針刀能夠恢復關節內良性應力刺激、修復軟骨[6-8]，但對軟骨下骨異常重塑是否具有調控作用尚不明確。本研究通過對軟骨下骨Micro-CT掃描及三維重建，探究針刀干預對軟骨下骨重塑的調控作用，揭示針刀治療KOA的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級6月齡健康雄性新西蘭兔30只，由北京科宇動物養殖中心提供（許可證號：SCXK京2018-0010），體質量2.0～2.5 kg，本實驗在中國中醫科學院中藥研究所完成，保證所有實驗動物單籠飼養，控制室溫20～24℃，相對濕度40%～60%，自由獲取食物和水，定期紫外線消毒。

1.2 試劑與儀器

樹脂繃帶（規格：15 cm×180 cm，珠海麗珠醫用生物材料有限公司）；高分子繃帶（規格7.5 cm×360 cm，蘇州可耐特醫療科技有限公司）；HZ系列一次性針刀（規格0.3 mm×30 mm，北京卓越華友醫療器械有限公司）；一次性無菌針灸針（規格0.2 mm×13 mm，環球牌，蘇州針灸用品有限公司）；二磷酸鹽（利塞磷酸鈉，Risedronate sodium，美國LKT Laboratories公司）；韓式穴位神經刺激儀（儀器型號LH202H，北京華為產業開發公司）；活體動物體內成像系統Quantum FX Micro-CT成像系統（儀器型號PE Quantum FX，美國PerkinElmer公司）。

1.3 分組與造模

采用隨機數字表法將30只雄性新西蘭兔隨機分為空白組、模型組、針刀組、電針組和骨代謝調節劑組，每組6只。制備KOA模型采用改良Videman法左后肢伸直位固定制動。由兩名操作者共同完成，一人將兔仰臥位固定在試驗臺上，另一人進行造模操作。操作者一手牽拉兔左后肢，使膝關節完全伸直，將樹脂繃帶于（75±10）℃熱水中浸泡軟化，墊脫脂棉于樹脂繃帶內以減緩壓力，再將兔左后肢用樹脂繃帶從腹股溝處至足趾固定，保持膝關節呈180°伸直位，踝關節呈60°背屈，外層用高分子材料進行加固，最外層用防啃咬繃帶包裹。保持末端足趾露出，以便觀察血供情況及有無腫脹。除空白組外，其余4組均按上述方法造模，固定制動9周。造模結束后，用隨機數字表法每組選取1只兔，處死后取膝關節軟骨下骨進行病理觀察，判斷其病理變化是否符合要求，若顯示造模成功即可拆除所有動物的制動材料。

1.4 干預方法

空白組不做任何處理，常規飼養，每天正常抓取、固定。模型組造模成功后常規飼養，每天正常抓取、固定。針刀組：拆除制動材料1周后，給予針刀干預治療。將KOA兔固定后，在左后肢膝關節周圍用龍膽紫定位，常規備皮、消毒，按照針刀四步進針規程操作，松解完成后取出針刀，用棉球按壓片刻止血。進針點及具體針刀操作如下。1）股內、外側肌腱止點：針刀刀刃平行肌腱、刀體與皮膚平面垂直進針，松解股內、外側肌腱延續處。2）股直肌肌腱止點：進針方向同上，松解髕骨上緣即股直肌肌腱移行處。3）股二頭肌肌腱止點：進針方向同上，松解股二頭肌肌腱移行處。4）鵝足囊：進針方向同上，松解鵝足囊，即縫匠肌、股薄肌及半腱肌的聯合腱，向肌腱與骨連接方向進行松解。每周治療1次，治療3周。電針組：拆除制動材料1周后開始電針治療。參照《實驗動物學》定位取穴，結合動物比較學方法、比較解剖取穴法及模擬骨度取穴法，選取曲泉、委陽、內膝眼和外膝眼干預治療。常規備皮、消毒，選定穴位后將毫針刺入約5 mm，針刺后接韓氏穴位神經刺激儀以疏密波行刺激治療，電針分別連接曲泉與委陽，內膝眼與外膝眼，頻率2/100 Hz，強度3 mA，留針15 min，隔天治療1次，共治療3周。骨代謝調節劑組：拆除制動材料1周后，皮下注射二磷酸鹽（利塞磷酸鈉，Risedronate sodium）0.01 mg/kg體質量，每天注射1次，共治療3周。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 行為學觀察 分別于制動措施解除后1周與干預結束后1周，采用改良Lequesne MG[9]膝關節級別評估量表對各組兔左側膝關節進行評估，分別從局部疼痛度、步態、關節活動度、關節腫脹度4個方面進行評分，總分越高表明膝關節功能障礙越嚴重。由2名人員分別進行評價后取兩者平均值。

1.5.2 取材 于干預結束1周后，用3%戊巴比妥鈉溶液按30 mg/kg劑量耳緣靜脈注射麻醉。左后肢腹股溝至踝關節范圍常規備皮、消毒，在無菌條件下切取關節面上下各2 cm骨的膝關節，清除多余軟組織，于-20℃環境下冷凍保存48 h后，進行Micro-CT檢查。

1.5.3 影像學檢測 采用Micro-CT進行軟骨下骨二維觀察、三維重建及定量分析軟骨下骨顯微結構參數變化。將兔膝關節標本置于Micro-CT檢測艙內，用繃帶捆綁固定以防止移位，掃描時沿標本長軸方向，掃描參數為：掃描分辨率45 μm，旋轉角度210°，旋轉角度增量0.5°，層間距20 μm，曝光時間2 960 ms，掃描時間18 min，對同一樣品500張不同截面圖片，選用1 000分割值，完成圖像二值化。三維重建時選用完整的軟骨下骨組織作為興趣區域（ROI），選定ROI內骨進行三維可視化呈現。用Micview V2.1.2三維重建處理軟件和ABA專用骨骼分析軟件進行定量分析。測量參數有骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁數量（Tb.N）及骨小梁間隔（Tb.Sp），骨密度（BMD），分為組織骨密度（tBMD）與體積骨密度（vBMD），骨體積分數（BVF）。

1.6 統計學處理

采用SPSS21.0統計軟件統計分析數據，首先檢驗正態性和方差齊性，若呈正態分布且方差齊則選用單因素方差分析（one-way，ANOVA），若不符合正態性檢驗或方差不齊則選用非參數檢驗法分析。樣本數據以（）表示。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著差異。

2 結 果

2.1 各組兔Lequesne MG行為學評分比較

見表1。采用改良Lequesne MG膝關節評分量表評估比較各組兔膝骨關節炎級別。結果顯示，與空白組相比，模型組改良Lequesne MG膝關節評分明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，針刀組、電針組評分明顯改善，差異有統計學意義（P＜0.01），骨代謝調節劑組評分無明顯改變，差異無統計學意義（P＞0.05）；電針組與針刀組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組兔Lequesne MG行為學評分比較（分，±s）

表1 各組兔Lequesne MG行為學評分比較（分，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白組模型組電針組針刀組骨代謝調節劑組n 6 6 6 6 6干預前0±0 7.00±0.89**7.33±0.82**7.33±0.82**7.17±0.98**干預后0±0 6.83±0.75**4.57±0.78△△4.57±0.78△△6.83±0.75

2.2 影像學檢測

2.2.1 Micro-CT成像 Micro-CT冠狀面二維圖像顯示，空白組軟骨下骨骨小梁呈網格狀均勻有序排列；模型組軟骨下骨骨板增厚，骨小梁局部斷裂扭曲，排列紊亂不均，部分呈融合表現，網狀結構消失；骨代謝調節劑組與模型組表現相似；電針組與針刀組較模型組明顯改善，軟骨下骨骨小梁形狀較為規則，排列較整齊有序。見圖1。三維重建圖可見模型組較空白組軟骨下骨骨髁邊緣生出大量骨贅，電針組與針刀組可見骨贅明顯減少，骨代謝調節劑組與模型組差別不明顯。

圖1 各組膝關節軟骨下骨Micro-CT冠狀面二維圖形

2.2.2 各組兔軟骨下骨顯微結構參數比較 見表2，表3。Micro-CT骨組織參數定量分析顯示，與空白組相比，模型組Tb.Th、Tb.N、BVF、vBMD及tBMD明顯升高；Tb.Sp明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，針刀組及電針組Tb.Th、Tb.N、BVF、vBMD及tBMD明顯降低；Tb.Sp明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。針刀組與電針組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），但針刀組相較電針組Tb.Th、Tb.Sp、vBMD及tBMD的改善趨勢更為明顯，更接近空白組。骨代謝調節劑組對比模型組各數據差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組兔軟骨下骨骨小梁厚度、間隔、數量參數比較（±s）

表2 各組兔軟骨下骨骨小梁厚度、間隔、數量參數比較（±s）

組別空白組模型組電針組針刀組骨代謝調節劑組n 6 6 6 6 6 Tb.Th（mm）0.618±0.074 0.818±0.069**0.671±0.048△△0.704±0.068**△△0.774±0.062**Tb.Sp（mm）0.770±0.094 0.671±0.043**0.755±0.040△△0.718±0.036△△0.640±0.058**Tb.N（1/mm）0.688±0.052△△0.821±0.055**0.727±0.095△0.722±0.058△0.760±0.073

表3 各組兔軟骨下骨密度、骨體積分數參數比較（±s）

表3 各組兔軟骨下骨密度、骨體積分數參數比較（±s）

組別空白組模型組電針組針刀組骨代謝調節劑組n 6 6 6 6 6 BVF（%）76.62±4.78 94.75±3.82**81.18±7.68△△81.67±3.67△△87.28±8.47**vBMD（mg/cm3）1 808.76±59.14 2 361.48±333.46**1 977.68±187.01△△2 028.32±115.78△2 323.40±257.50**tBMD（mg/cm3）2 371.71±57.95 2 945.82±239.80**2 479.25±320.68△△2 628.21±232.50△2 754.77±218.23**

3 討 論

本實驗選用新西蘭兔作為實驗動物，兔易于獲取和飼養，關節體積較大，其大體結構與人類關節相似，取材時操作方便，可用于實驗觀察的組織多[10]。目前常用的KOA模型的制備方法大致分為手術法和非手術法，非手術法中較為常見的有關節制動和關節腔注射，前期研究表明各種原因引起的膝周生物力學失衡是導致KOA的重要因素，因此關節制動法更能復刻出力學失衡環境下導致KOA的發病過程，故本實驗采用改良Videman法制備動物模型。

近年來越來越多的研究表明軟骨下骨在KOA發生發展中具有重要意義。在膝關節中軟骨下骨位于軟骨下方，由軟骨下骨板和軟骨下骨小梁兩部分組成，具有吸收機械應力、緩沖振動和維持關節正常形態等功能。正常情況下，軟骨下骨可緩沖關節內約30%的機械應力，從而避免過于集中的應力對關節軟骨造成的損害[11]。軟骨下骨重塑在生理狀態下始終處于動態平衡，在成骨細胞和破骨細胞的共同作用下，維持軟骨下骨微結構穩定，保證關節能夠適應日常機械負荷[12]。但當機械應力超過關節的適應能力時，該動態平衡被打破，導致軟骨下骨出現異常重塑，在KOA早期，骨吸收占主導，在中晚期，骨形成占主導。具體表現為早期破骨細胞降解活性增強，骨吸收增多，致使軟骨下骨呈骨質疏松樣改變。但骨體積減小后對異常應力的負荷能力下降，為維持正常的生物力學性能，中晚期時成骨細胞的成骨活性增強，骨形成明顯，骨小梁由原先稀疏多孔變得逐漸致密化，軟骨下骨板增厚[13-14]。上述改變導致關節內機械應力分布不均，軟骨下骨吸收機械應力和緩沖震蕩的能力下降，使軟骨過度負荷，進而出現磨損和退變，軟骨退變又反作用于軟骨下骨，進一步加劇異常骨形成，加速KOA的發生發展[15]。有大量研究證實，通過改善異常骨形成，使軟骨下骨向正常狀態轉化，對外界應力的承受能力增強，延緩軟骨退變，達到緩解KOA的目的。

Micro-CT是近年來新興的能夠精確顯示骨顯微結構的設備，有分辨率高、檢查速度快、無損傷等優點，相較于傳統的X線、CT和骨密度測量等方法，可以更精確地測量出所需數據，同時兼具三維重建的功能，彌補了二維圖像無法判斷骨小梁三維結構的不足，在研究骨的結構及力學分析方面得到了廣泛的應用[16]。

在此次研究中，我們通過Micro-CT對軟骨下骨二維觀察、三維重建并檢測其顯微結構，發現在造模9周后模型組兔膝關節二維冠狀面出現骨小梁排列不均，斷裂融合等現象，三維重建顯示骨髁邊緣骨贅增多，顯微結構顯示軟骨下骨Tb.Th、BVF、Tb.N、BMD均明顯升高，Tb.Sp明顯降低，是中晚期KOA的明確特征[17]。證明在異常機械應力的作用下，軟骨下骨出現了結構上的改變，干預治療后，針刀和電針組兔膝關節軟骨下骨骨贅明顯減少，Tb.Th、BVF、Tb.N、BMD均顯著降低，Tb.Sp升高，針刀組較電針組改善趨勢更明顯，證明針刀可改善軟骨下骨骨形成。

KOA屬中醫學“膝痹病”的范疇，隨著病程的進展病位由“筋”發展至“骨”。《素問·痿論》曰“宗筋主束骨而利機關也”，闡明了筋的作用，即“筋”發生病變，其協理關節的功能失常，若不加以干預將進展發生“骨病”，而“骨病”又會反作用于筋，加重“筋傷”，二者相互影響，最終導致“筋錯縫”“骨出槽”的病理狀態。《素問·調經論》中指出“病在筋，調之筋；病在骨，調之骨”，是后世有效治療KOA的思路來源。針刀在臨床上的治療原則不僅僅是對壓痛點及因應力失衡代償形成的條索狀物進行“燔針劫刺”，還對周圍與維持膝關節生物力學平衡起關鍵作用的軟組織進行松解，進一步達到“調筋”的目的，通過重塑關節內部的良性應力平衡，有效緩解軟骨下骨異常重塑和軟骨降解從而達到“治骨”的目的，為打破“筋骨同病”的惡性循環提供突破口，對治療KOA有重要意義。

二磷酸鹽是一種有效的骨吸收抑制劑，主要作用是抑制破骨細胞的降解活性，可以有效減少軟骨下骨骨量的丟失，使軟骨下骨微結構維持正常狀態[18]，但在本次實驗中，骨代謝調節劑組與模型組各項數據均未見顯著差異，我們推測可能是因為二磷酸鹽的抑制作用主要針對破骨細胞，而本實驗造模9周后模型兔KOA已發展至中晚期，軟骨下骨以成骨細胞的成骨作用為主，主要表現為異常骨形成，因此二磷酸鹽的作用不明顯。

綜上所述，針刀通過對膝關節局部組織進行松解，可有效改善中晚期軟骨下骨的異常骨重塑，延緩KOA的進展，對于治療KOA有重要意義。