超聲波輔助龍蝦殼制備谷氨酸螯合鈣的工藝優化

朱繼國，廖濤，熊光權，王炬光，白嬋*，張慶芳*

(1.蘭州理工大學 石油化工學院，蘭州 730050；2.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所,武漢 430064)

近幾年，隨著小龍蝦消費市場不斷擴大，小龍蝦養殖產量持續快速增長。2018年小龍蝦總產量達163.87萬噸[1]，2019年小龍蝦總產量高達190.6萬噸。在工業中，加工后的整個蝦中約有45%～60%變成副產品(頭部和硬殼)[2]，蝦殼中主要含有甲殼質(15%～40%)、蛋白質(20%～40%)和碳酸鈣(20%～40%)[3]。鈣是人體不可或缺的營養素之一，涉及了大量的重要功能[4]，鈣的攝入量不足導致鈣缺乏，會引起多種疾病。目前鈣補充劑的種類繁多，其中氨基酸螯合鈣因性質穩定，鈣吸收率高于無機鈣，易吸收，副作用小，同時還可以補充氨基酸，具有雙重作用，被認為是較理想的鈣補充劑。谷氨酸螯合鈣是新型食品添加劑，安全性高，可以代替部分食鹽，減少食鹽攝入量，增加鈣質攝入[5]，增強食品口感，且鈣的吸收效率是無機鈣(CaCl2)的1.64倍。目前谷氨酸的制備主要是谷氨酸與貝殼、雞蛋殼中和反應制備，而目前關于利用龍蝦殼制備谷氨酸螯合鈣的文章鮮有報道。因此，文章以蝦殼中的鈣為鈣源，在超聲波的輔助下，以鈣螯合率為指標制備谷氨酸螯合鈣，并用響應面法優化制備工藝，從而確定最佳的工藝條件，為廢棄蝦殼資源的再利用提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

小龍蝦：購于武漢悅活里超市；L-谷氨酸：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；鈣羧酸、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸鈉、硫化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、無水硫酸銅、硫酸鎂、無水乙醇、石油醚、氯化鑭、碘化鉀、酒石酸鉀鈉等：國藥集團化學試劑有限公司；硝酸和高氯酸：均為優級純。

1.1.2 儀器與設備

ME303E電子分析天平 梅特勒-托利多國際貿易有限公司；消化爐、電熱恒溫干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；集熱式恒溫磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司；SZF-06C脂肪測定儀 上海洪紀儀器設備有限公司；離心機；液晶超聲波清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司；K9860全自動凱氏定氮儀 徐州淮博儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

小龍蝦→蝦殼粉→加谷氨酸→超聲處理→抽濾上清液→無水乙醇→離心→抽濾→干燥→成品。

1.2.2 蝦殼粉的制備

將小龍蝦除去全部肉質，蝦殼用自來水反復清洗去除泥土及粘附的雜質，置于105 ℃鼓風干燥箱中烘干 24 h。將干燥好的蝦殼先用破碎機粉碎30 s，再將粉碎后的蝦殼粉用超微粉碎機粉碎20 min，然后收集分裝密封備用。

1.2.3 蝦殼營養成分分析

水分含量的測定：采用直接干燥法(GB 5009.3—2016)[6]；灰分含量的測定：采用灼燒稱重法(GB 5009.4—2016)[7]；粗蛋白含量的測定：采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)[8]；粗脂肪含量的測定：采用索氏抽提法(GB 5009.6—2016)[9]；鈣含量的測定：采用原子吸收分光光度法(GB 5009.92—2016)[10]。

1.2.4 制備谷氨酸螯合鈣的工藝流程

取1 g蝦殼粉加入到50 mL的錐形瓶中，再加入一定量的蒸餾水，在攪拌下直接加入稱量好的谷氨酸，然后將錐形瓶放入超聲波清洗儀中，超聲波處理一段時間后，取出錐形瓶放置水浴鍋中水浴一段時間。

待反應結束后趁熱抽濾收集濾液，由于谷氨酸螯合鈣不溶于無水乙醇，將濾液與其等體積的無水乙醇混合進行沉淀，靜置2 h后，通過高速離心過濾收集濾渣，并用無水乙醇多次洗滌濾渣，除去殘余的谷氨酸及其他附著在其表面的殘留物，將經過多次洗滌的濾渣置于 60 ℃的干燥箱內干燥6 h達到恒重即可得到谷氨酸螯合鈣成品，然后測定谷氨酸螯合鈣的螯合率。

1.2.5 鈣含量的測定

利用原子吸收分光光度法測定谷氨酸螯合鈣產品中的含鈣量，谷氨酸螯合鈣產品的螯合產率(X)計算公式如下：

式中：X為賴氨酸螯合鈣產品的螯合產率(%)；m0為蝦殼粉中鈣元素的總質量(mg)；m1為螯合態鈣元素的質量(mg) 。

1.3 單因素試驗設計

1.3.1 摩爾比對螯合率的影響

蝦殼粉1.0 g，摩爾比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，料液比1∶20 (g/mL)，超聲時間20 min，反應溫度55 ℃，超聲功率100 W，螯合時間60 min，然后經乙醇沉淀、離心抽濾、洗脫干燥后制得谷氨酸螯合鈣，測鈣的螯合率。

1.3.2 料液比對螯合率的影響

蝦殼粉1.0 g，摩爾比3∶1，料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g/mL)，超聲時間20 min，反應溫度55 ℃，超聲功率100 W，螯合時間60 min，然后經乙醇沉淀、離心抽濾、洗脫干燥后制得谷氨酸螯合鈣，測鈣的螯合率。

1.3.3 超聲時間對螯合率的影響

蝦殼粉1.0 g，摩爾比3∶1，料液比1∶30(g/mL)，超聲時間10，15，20，25，30 min，反應溫度55 ℃，反應功率100 W，螯合時間60 min，然后經乙醇沉淀、離心抽濾、洗脫干燥后制得谷氨酸螯合鈣，測鈣的螯合率。

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1.3.4 反應溫度對螯合率的影響

蝦殼粉1.0 g，摩爾比3∶1，料液比1∶30(g/mL)，超聲時間25 min，反應溫度35，45，55，65，75 ℃，超聲功率100 W，螯合時間60 min，然后經乙醇沉淀、離心抽濾、洗脫干燥后制得谷氨酸螯合鈣，測鈣的螯合率。

1.3.5 超聲功率對螯合率的影響

蝦殼粉1.0 g，摩爾比3∶1，料液比1∶30(g/mL)，超聲時間25 min，反應溫度65 ℃，超聲功率60，70，80，90，100 W，螯合時間60 min，然后經乙醇沉淀、離心抽濾、洗脫干燥后制得谷氨酸螯合鈣，測鈣的螯合率。

1.4 響應面試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，篩選出較合適的反應條件，為驗證各反應條件的準確性，選擇摩爾比(A)、料液比(B)、超聲時間(C)、反應溫度(D)為響應因素，以谷氨酸螯合鈣的螯合率為響應值，得出最佳工藝參數。設計四因素三水平試驗，見表1。

表1 谷氨酸螯合鈣響應面試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels of glutamate calcium chelate

1.5 數據統計分析

試驗數據采用 SPSS 25.0軟件進行方差分析，采用Origin 2018軟件繪圖，采用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 蝦殼的基本成分

小龍蝦蝦殼的基本成分見表2。

表2 小龍蝦殼的基本組成成分(以干重計)Table 2 The basic components of lobster shells (calculated by dry weight)

由表2可知，蝦殼中粗甲殼素的含量最高，為28%，其次為鈣元素含量19.304%，粗蛋白的含量為14.48%，水分的含量為7.69%，粗脂肪的含量為0.2%。蝦殼中的鈣主要以碳酸鈣的形式存在，是天然的優質鈣源，目前蝦殼中鈣的提取方法主要有高溫煅燒法、直接中和法和發酵法，將蝦殼中的無機鈣轉化成有機鈣，魏穎等[11]采用乳酸提取法從克氏原螯蝦蝦殼中提取乳酸鈣，從10 g蝦殼粉中提取鈣762.48 mg。

2.2 谷氨酸螯合鈣制備工藝條件的單因素試驗

2.2.1 谷氨酸與蝦殼粉中鈣的不同摩爾比對鈣螯合率的影響

由圖1可知，谷氨酸螯合鈣的螯合率隨著谷氨酸與蝦殼中碳酸鈣的摩爾比的增加而升高，摩爾比在1∶1～3∶1的過程中，螯合率顯著增加，當繼續增加摩爾比時，螯合率有所增加，但是變化不明顯。這是因為谷氨酸與碳酸鈣反應生成谷氨酸螯合鈣的理論摩爾比為2∶1[12]，當反應體系中的摩爾比比理論摩爾比高時，將有利于促進鈣離子的螯合，但當谷氨酸螯合鈣已經達到了一種平衡狀態后，繼續增加摩爾比，對促進鈣離子的螯合率的影響并不大，而且谷氨酸的利用率降低，造成資源浪費。所以，當谷氨酸與碳酸鈣的摩爾比為3∶1時較為合理，可以獲得理想的螯合率。

圖1 摩爾比對鈣的螯合率的影響Fig.1 Effect of molar ratios on the chelation rates of calcium

2.2.2 料液比對鈣螯合率的影響

由圖2可知，鈣的螯合率隨著料液比的變化先升高后降低，當料液比為1∶30時，鈣的螯合率最高，為87.25%，可能是當料液比較小時，會導致產物谷氨酸螯合鈣的濃度太大，使反應體系溶液易達到飽和，不利于反應向生成谷氨酸螯合鈣的方向進行[13]，因此隨著料液比增大，鈣的螯合率升高；但當料液比太大時，即反應物稀釋過大，分子間的有效碰撞減小，阻礙了螯合反應的進行，所以鈣的螯合率降低。因此，最佳的料液比為1∶30，可以獲得理想的螯合率。

圖2 料液比對鈣的螯合率的影響Fig.2 Effect of the solid-liquid ratios on the chelation rate of calcium

2.2.3 超聲時間對鈣螯合率的影響

由圖3可知，當超聲時間少于25 min時，鈣的螯合率隨著超聲時間的增加而升高，當超聲時間超過25 min后，螯合率降低，在超聲時間為25 min時螯合率最高，為89.78%。超聲時間對谷氨酸螯合鈣的影響具有兩面性，超聲處理可促進物料與溶劑間的接觸，提高反應體系中分子的碰撞頻率，從而加速反應過程，但超聲處理時間過長會破壞產物晶體的生成，或改變產品的物理性質[14]。因此，最佳的超聲時間為25 min。

圖3 超聲時間對鈣的螯合率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the chelation rate of calcium

2.2.4 溫度對鈣螯合率的影響

由圖4可知，隨著溫度的增高，螯合率逐漸升高，當溫度為65 ℃時螯合率最高，為90.58%。當溫度繼續增高時，螯合率降低，當溫度為75 ℃，螯合率為81.58%，比溫度為65 ℃時的螯合率減少了9%。隨著溫度的上升，分子運動加劇，加大了分子間的碰撞幾率，加快了反應速率，產品的螯合產率自然會隨之升高[15]。在溫度較高時，螯合物在高溫條件下會發生一定程度的分解，導致螯合率下降。因此，最佳的反應溫度為65 ℃。

圖4 反應溫度對鈣的螯合率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the chelation rate of calcium

2.2.5 超聲功率對鈣螯合率的影響

超聲波的空穴作用有助于晶核的形成，加快晶體的生長速率,提高反應速率，縮短反應時間[16]。由圖5可知，隨著超聲功率的增加，鈣的螯合率逐漸升高，當超聲功率為100 W時鈣的螯合率最高，為90.90%。梁春娜等[17]在采用超聲波法從雞蛋殼中制備醋酸鈣工藝研究中，所得最佳工藝中超聲波功率為100 W。超聲功率過大，強烈空化作用產生的能量會破壞晶體的生成和增大，只有功率達到一定范圍時，才有強化成核或強化結晶作用。因此，最佳的超聲功率為100 W。

圖5 超聲功率對鈣的螯合率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the chelation rate of calcium

2.3 谷氨酸螯合鈣制備的響應面試驗

根據單因素試驗結果，固定超聲功率為100 W，反應時間為60 min，以摩爾比(A)、料液比(B)、超聲時間(C)、反應溫度(D)為試驗因素，以谷氨酸螯合鈣的螯合率為響應值，由Design-Expert V8.0.6軟件設計出的試驗方案及結果見表3。

表3 響應面設計試驗及結果Table 3 Response surface design test and results

續 表

通過表3的試驗數據，采用 Design-Expert V8.0.6軟件進行擬合，得谷氨酸螯合鈣的螯合率對摩爾比(A)、料液比(B)、超聲時間(C)、反應溫度(D)的二次多項回歸模型方程：鈣螯合率=91.72+2.65A+1.73B-0.49C+0.25D-1.68AB-1.12AC-3.76AD+0.85BC-1.82BD-0.66CD-1.53A2-1.84B2-1.49C2-3.54D2。

由表4可知，模型的F=10.03，P<0.0001，表明回歸模型極顯著；本試驗失擬誤差 P=0.5687>0.05，失擬檢驗是一種用來判斷回歸模型是否可以接受的檢驗，說明該模型與試驗擬合誤差不顯著，擬合度較好，數據較準確，該模型可以使用；本試驗相關系數R2=0.9093，說明有90.93%的數據可以用此方程解釋；變異系數C.V.=1.68%，C.V.表示試驗的精確度，值越小，試驗的可靠性越高，模型越精確，重現性很好[18]。綜上所述，該模型的擬合度較好，能充分反映出各試驗因素與螯合率之間的關系，可以用該模型對鈣的螯合率進行分析和預測。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

回歸模型中一次項A和B、交互項AD及二次項B2和D2的P值均小于0.01，對鈣螯合率的影響極顯著，交互項AB和BD及二次項A2和C2的P值均小于0.05，對鈣螯合率的影響顯著(P<0.05)。通過比較各因素的 F值大小可判定各因素的主次關系，F值越大，則該因素對試驗結果的影響越大[19]，因此各因素對鈣螯合率的影響主次為A>B>C>D，即摩爾比>料液比>超聲時間>反應溫度。

2.3.1 響應面結果分析

響應曲面分析法優化圖形為響應值與對應的因素間構成的三維圖及在二維平面上的等高線圖，綜合直觀地反映各因素對響應值的影響，每個響應面對其中兩個因素進行分析，其他試驗因素固定在零水平上。響應面坡度越陡，表明該響應值試驗因素的變化越敏感，該試驗因素對響應值的影響越大；反之則表明該試驗因素對響應值的影響越小[20]；等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著[21]。由圖6可知，摩爾比和反應溫度、摩爾比和料液比及料液比和反應溫度對谷氨酸螯合鈣螯合率的交互作用顯著，與上述方差分析的結果一致。

圖6 試驗因素交互作用對鈣螯合率的影響Fig.6 Effect of interaction of test factors on the chelation rate of calcium

2.3.2 響應面結果及驗證

通過回歸模型的預測，谷氨酸螯合鈣理論的最佳制備工藝條件為摩爾比4∶1、料液比1∶30.85、超聲時間23.25 min、反應溫度59.9 ℃，此條件下谷氨酸螯合鈣的螯合率為94.02%?？紤]實際操作的局限性，工藝最終修正為摩爾比4∶1、料液比1∶31、超聲時間23 min、反應溫度60 ℃。在此條件下進行驗證，并與取消超聲輔助步驟(反應23 min)試驗組進行對比，每組平行測定3次。測得谷氨酸螯合鈣的螯合產率為93.68%，與預測值94.02%接近，說明該模型與實際情況的擬合度較好，該模型能較好地預測實際谷氨酸螯合鈣的螯合率。取消超聲輔助步驟試驗組的谷氨酸螯合鈣的螯合率76.15%，比超聲輔助組少17.53%。

3 結論

根據單因素試驗結果，利用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應面分析，各因素的效應關系為摩爾比>料液比>超聲時間>反應溫度，摩爾比和反應溫度的交互作用對谷氨酸螯合鈣的螯合產率影響最為明顯；其最優制備工藝為摩爾比4∶1、料液比1∶31、超聲時間23 min、反應溫度60 ℃，在此條件下，谷氨酸螯合鈣的螯合產率為93.68%，且比取消超聲輔助步驟試驗組高17.53%，因此超聲波輔助制備工藝可顯著提升蝦殼谷氨酸螯合鈣的螯合率。本試驗以小龍蝦副產物蝦殼和谷氨酸為原料，在超聲波的輔助下制備谷氨酸螯合鈣，為綜合利用我國豐富的蝦殼資源提供了參考。