基于傳統分離培養和高通量測序不同孔徑陶瓷膜過濾前后泡菜汁中微生物變化的研究

王玉梅，李洋，羅佳沂，李凱，毛瑞豐

(廣西大學 輕工與食品工程學院，南寧 530004)

泡菜是以新鮮果蔬為原料，輔以香辛料，添加或不添加發酵劑，采用鹽水浸漬厭氧發酵制作而成的[1-2]。泡菜中含有豐富的礦物質[3]、氨基酸[4]、有機酸[5]、維生素[6]等營養物質，在發酵后期泡菜風味物質含量豐富，不僅能滿足人體所需要的營養物質，而且具有酸、鮮、爽、脆、嫩等特點[7-9]。近年來，膜過濾技術發展相當迅速，已經廣泛應用于各行各業，包括污水處理[10-11]、化工[12-13]、食品[14-15]、醫療、氣體分離等。

陶瓷膜是以壓力泵驅動帶來膜內外的壓力差，促使料液樣品中的小分子物質和水在壓力的驅動下透過膜，而一些大分子(膠體、酚類物質、蛋白及微生物等)且粒徑遠遠大于膜孔徑的物質被截留，從而達到除菌和澄清的效果[16-17]。本研究采用傳統生物學以及高通量測序技術分析不同孔徑陶瓷膜對泡菜汁微生物截留的種類、差異性及菌相的變化，并對陶瓷膜孔徑不同對微生物截留的差異性進行討論，為今后陶瓷膜處理應用于發酵類產品除菌的研究與應用提供了理論依據，也為泡菜汁的綜合利用及多元化發展提供了優質原料。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗原料

泡菜汁：由廣西某泡菜廠提供。取得的泡菜汁經8層滅菌紗布過濾之后即可作為膜處理的原料液。分別在溫度TEM=40 ℃,膜面流速為CFV=4～5 m/s, 跨膜壓差為TMP0.008=0.5 MPa、TMP0.05=0.35 MPa、TMP0.2=0.3 MPa、TMP0.5=0.25 MPa的條件下過濾泡菜汁。

1.2 實驗設備

孔徑為0.008，0.05，0.2，0.5 μm的陶瓷膜及陶瓷膜中試設備。

1.3 實驗方法

1.3.1 陶瓷膜處理前后細菌和真菌的分離純化

取3 mL經陶瓷膜處理的泡菜汁及原泡菜汁樣品于無菌平板中，用平板傾注法分別倒NA、PDA平板。待平板凝固后，將NA平板倒置放在37 ℃生化培養箱中培養48 h，將PDA平板倒置放在28 ℃生化培養箱中培養96 h，然后對平板內的細菌和真菌菌株分離純化，分離純化方法采用平板劃線法，直到獲得純化的單菌落保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2 DNA的提取及PCR擴增

將分離的細菌于LB液體培養基中培養15 h，參考細菌DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取、將分離的真菌于PDB液體培養基中培養72 h，參考真菌DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取。PCR擴增采用50 μL反應體系：

細菌擴增引物：27F/1492R 27F：5′-AGAGTTT-GATCCTGGCTCAG-3′；

1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′；

真菌擴增引物：ITS1/ITS4 ITS1：5′-TCCGTA-GGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

表1 PCR擴增程序Table 1 PCR amplification program

表2 PCR反應條件Table 2 PCR reaction conditions

1.3.3 DNA與PCR擴增產物的保存方法

DNA與PCR產物分別放置在滅菌的1.5 mL的離心管和PCR管中密封，-20 ℃保存備用。

1.3.4 DNA測序及序列相似性對比

對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得清晰明亮的條帶， PCR產物委托生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

16S rRNA和ITS序列分析：序列分析登錄NCBI數據庫，應用BLAST程序分別對所測得的16S rRNA 和ITS序列與GenBank中的核酸進行相似性比對。采用軟件Clustal X1.83 進行多序列的比對，并將對位排列結果中5′和3′端的非對位排列區手動刪除。預處理好的DNA序列利用MEGA 7.0軟件[18]計算序列的堿基組成(compute nucleotide composition)[19]、計算遺傳距離[20]、構建系統發育樹[21]、檢驗各分支的置信度[22]。遺傳距離基于Kimura 2-parameter模式計算、系統發育樹基于neighbor-joining(NJ)法構建，各分支的置信度利用自展法(Bootstrap重復1000次)檢驗。

1.3.5 高通量測序

分別稱取200 mg 4種不同孔徑陶瓷膜處理前后的泡菜汁樣品，放入滅菌后的2 mL離心管中，加入1 mL體積分數為70%的乙醇溶液，振蕩混勻，以10000 r/min室溫離心3 min，棄上層液體。加入磷酸鹽緩沖液溶液(0.01 mol/L，pH 7.2)，振蕩混勻，以10000 r/min室溫離心 3 min，棄上層液體。按照 Power Soil DNA Isolation Kit說明書分別提取4種不同孔徑陶瓷膜處理前后的泡菜汁樣品的細菌、真菌群的宏基因組DNA，利用 Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對提取的基因組DNA進行精確定量。以提取的宏基因組DNA為模板，采用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌的16S rRNA(V3-V4)區序列進行PCR擴增。引物SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)對真菌的ITS(ITS1-ITS2)區序列進行PCR擴增：PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，共20個循環；72 ℃再延伸 10 min。PCR 擴增體系(20 μL)：5×Fast Pfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,正向及反向引物(5 μmol/L)各 0.8 μL，Fast Pfu Polymerase 0.4 μL, BSA 0.2 μL，模板 DNA 10 ng，補雙蒸水(ddH2O)至20 μL。利用Min Eluter PCR Purification Kit對PCR 擴增產物進行純化,PCR 擴增產物經2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用膠回收試劑盒對PCR目的條帶進行純化回收。利用 Tru-Seq rDNA PCR-Free Sample Preparation Kit制備測序文庫并添加接頭序列，經過Nano Drop 2000測定文庫質量后，利用Illumina HiSeq 2500測序平臺進行高通量測序。

1.4 實驗數據分析

根據97%相似性[23]，將非重復序列進行操作分類單元(OTU)聚類，然后采用RDP Classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，統計4種不同孔徑陶瓷膜處理前后泡菜汁樣品的微生物在不同水平的群落組成。利用Mothur軟件繪制稀釋性曲線進行Alpha多樣性分析[24]，利用QIIME軟件計算樣品的各種多樣性指數，原始實驗數據處理采用Excel軟件，每組實驗重復3次，實驗數據采用Origin 2019b軟件進行繪制。

2 結果與討論

2.1 基因組DNA提取和PCR擴增

以提取的37株細菌、33株乳酸菌及14株真菌的DNA為模板，細菌和乳酸菌以27F和1492R為引物，進行16S rRNA擴增，真菌以ITS1和ITS4為引物，進行ITS擴增，并將得到的PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖1。

注:圖中1～37分別代表Q0-1、Q0-2、Q0-3、Q0-4、Q0-5、Q0-6、Q0-7、Q0-8、Q0-9、Q0-10、Q0-11、Q0-12、Q0-13、Q0-14、Q0-15、Q0-16、Q0-17、Q0-18、Q500-1、Q500-2、Q500-3、Q500-4、Q500-5、Q500-6、Q500-7、Q500-8、Q500-9、Q200-1、Q200-2、Q200-3、Q200-4、Q200-5、Q200-6、Q50-1、Q50-2、Q50-3、Q50-4。

注:圖中1～33分別代表M0-1、M0-2、M0-3、M0-4、M0-5、M0-6、M0-7、M0-8、M0-9、M0-10、M0-11、M0-12、M0-13、M0-14、M0-15、M500-1、M500-2、M500-3、M500-4、M500-5、M500-6、M500-7、M500-8、M200-1、M200-2、M200-3、M200-4、M200-5、M200-6、M50-1、M50-2、M50-3、M50-4。

注:圖中1～14分別代表P0-1、P0-2、P0-3、P0-4、P0-5、P0-6、P0-7、P0-8、P500-1、P500-2、P500-3、P500-4、P200-1、P200-2。

由圖1可知，37株細菌、33株乳酸菌和14株真菌擴增產物都是條帶明亮清晰且單一不拖尾，無非特異擴增現象，且細菌菌株和乳酸菌菌株的16S rRNA序列片段大小均在1200～1400 bp左右，真菌菌株的ITS序列片段大小均在600 bp左右，滿足測序要求。

2.2 細菌分離鑒定結果

2.2.1 16S rRNA序列分析及遺傳距離

將不同孔徑陶瓷膜處理后泡菜汁中細菌分離純化得58株細菌菌株及72株乳酸菌菌株，將其中37株(原泡菜汁中18株；0.5 μm陶瓷膜處理后泡菜汁9株；0.2 μm 陶瓷膜處理后泡菜汁6株；0.05 μm陶瓷膜處理后泡菜汁4株)細菌和33株(原泡菜汁中15株；0.5 μm陶瓷膜處理后泡菜汁8株；0.2 μm陶瓷膜處理后泡菜汁6株；0.05 μm陶瓷膜處理后泡菜汁4株)乳酸菌進行微生物菌種鑒定。測序結果顯示：在去除兩端16S rRNA引物序列后，應用MEGA 7.0軟件將37個細菌和33個乳酸菌菌株16S rRNA基因序列進行多序列對比后計算得到GC含量表，見表3。

表3 細菌16S rRNA序列的GC含量及序列長度Table 3 GC content and sequence lengths of 16S rRNA of bacteria

續 表

由表3可知，37個細菌株GC含量在50.95%～58.03%。16S rRNA對齊序列長度在1005～1205 bp。此外，37個不同序列間的平均遺傳距離(D)為0.0328。33個乳酸菌菌株GC含量在50.16%～54.23%。16S rRNA對齊序列長度在990～1180 bp。此外，33個乳酸菌不同序列間的平均遺傳距離(D)為 0.6131。

2.2.2 16S rRNA系統發育分析

將37株細菌菌株和33株乳酸菌的基因序列，采用GenBank序列數據庫，在NCBI上根據BLAST檢索，搜索與上述所測得序列相似度較高的16S rRNA序列，分析比較后刪除相同的序列，最終篩選最相似的16S rRNA序列與供試菌株序列的NJ法進行系統發育樹的構建。

細菌結果見圖2，細菌的NJ系統進化樹各主分支的自舉支持率范圍在82%～100%，且各主分支的后驗概率大部分在0.90～1.0之間。最終將37株供試菌株歸為4個屬，分別為芽孢桿菌(Bacillus)、放線菌屬(Actinobacteriotas)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)和短桿菌屬(Brevibacillus)，以及14個種，分別為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、嬰兒芽孢桿菌(Bacillusinfantis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蟬桿菌(Bacillusciccensis)、放線菌(Actinobacteriabacterium)、馬賽短芽孢桿菌(Brevibacillusmassiliensis)、橙色短波單胞菌(Brevundimonasaurantiaca)、堀越氏芽孢桿菌(Bacillushorikoshii)、Bacillusgottheilii、Brevundimonascaseigenomic strain、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)及絲狀芽孢桿菌(Bacillusfilamentosus)。經過0.5 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中檢測出8種細菌分別是蟬桿菌(Bacillusciccensis)、放線菌(Actinobacteriabacterium)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)、嬰兒芽孢桿菌(Bacillusinfantis)和貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。經過0.2 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中檢測出5種細菌，分別是蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)、嬰兒芽孢桿菌(Bacillusinfantis)和貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。經過0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中檢測出3種細菌分別是解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)和貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。經過0.008 μm陶瓷膜處理后，未能成功分離鑒定出細菌。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)對病原菌和一些青霉有一定的抑制作用[25]。從基因組學上來說，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)的后期異形體[26]。短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)微生物本身無毒無害且無污染，且對一些引起食品腐敗微生物抑制產生積極作用[27-29]。

圖2 基于16S rRNA序列的37株細菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 37 strains of bacteria based on 16S rRNA sequence

乳酸菌結果見圖3，乳酸菌的NJ系統進化樹各主分支的自舉支持率范圍在97%～100%，且各主分支的后驗概率大部分在0.95～1.0之間。最終將33株供試菌株歸為2個屬，分別為乳桿菌屬(Lactobacillus)和黏液乳桿菌屬(Limosilactobacillus), 以及13個種，分別發酵黏液乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum)、乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)。經過0.5，0.2，0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中乳酸菌的截留率雖能達到89.396%以上，但泡菜汁中仍能檢測出3種乳酸菌，包括乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)。

圖3 基于16S rRNA序列的33株乳酸菌的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 33 strains of lactic acid bacteria based on 16S rRNA sequence

經陶瓷膜處理后，泡菜汁中的微生物種類減少，且隨著陶瓷膜孔徑的降低，泡菜汁中微生物的種類越少，且經過0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中幾乎未檢出對人體產生毒害的細菌，而經過陶瓷膜處理的泡菜汁中含有的短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)能對后續作為老湯再利用提供良好的抑菌效果，于此同時乳酸菌也能在一定程度上加快發酵速度，縮短發酵周期。

2.3 真菌分離鑒定結果

2.3.1 ITS序列分析及遺傳距離

4種不同孔徑膜過濾后泡菜汁中，分離純化得30株真菌，將其中14株，原泡菜汁中8株、0.5 μm孔徑膜過濾后泡菜汁4株、0.2 μm孔徑膜過濾后泡菜汁2株，對其進行微生物菌種鑒定。測序結果顯示：在去除兩端ITS引物序列后，應用MEGA 7.0軟件將14個菌株ITS基因序列進行多序列對比后計算得到GC含量，見表4。

表4 真菌ITS序列的GC含量及序列長度Table 4 GC content and sequence lengths of ITS of fungi

結果顯示：14個菌株的GC含量在41.93%～51.35%。ITS對齊序列長度在472～498 bp。此外，14個不同序列間的平均遺傳距離(D)為 0.0677。

2.3.2 系統發育分析

將14株真菌株的基因序列，采用GenBank序列數據庫，在NCBI上根據BLAST檢索，搜索與上述所測得序列相似度較高的ITS序列，分析比較后刪除相同的序列，最終篩選最相似的ITS序列與供試菌株序列的NJ法進行系統發育樹的構建。

由圖4可知，真菌的NJ系統進化樹各主分支的自舉支持率范圍在97%～100%，且各主分支的后驗概率大部分在0.96～1.0之間。最終將14株供試菌株歸為4個屬，分別為曲霉菌屬(Aspergillus)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)和畢赤酵母屬(Pichias)，以及4個種，分別為謝瓦曲霉(Aspergilluschevalieri)、卡尼克酵母菌(Sporobolomycescarnicolor)、鎖擲孢酵母菌(Sporidioboluspararoseus)和庫德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。經過0.5 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中檢測出3種真菌分別是卡尼克酵母菌(Sporobolomycescarnicolor)、鎖擲孢酵母菌(Sporidioboluspararoseus)和庫德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。經過0.2 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中檢測出3種真菌，分別是鎖擲孢酵母菌(Sporidioboluspararoseus)和庫德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。經0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中的真菌未達到檢出限。

圖4 基于ITS序列的14株真菌的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 14 strains of fungi based on ITS sequence

2.4 不同孔徑陶瓷膜處理后泡菜汁中微生物多樣性分析

2.4.1 基因組提取和PCR擴增

以提取的37株細菌、33株乳酸菌及14株真菌的DNA為模板，細菌和乳酸菌以27F和1492R為引物進行16S rRNA擴增，真菌以ITS1和ITS4為引物進行ITS擴增，并將得到的PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示：37株細菌、33株乳酸菌和14株真菌擴增產物都是條帶明亮清晰且單一不拖尾，無非特異擴增現象，且細菌菌株和乳酸菌菌株的16S rRNA序列片段大小均在1200～1400 bp左右，真菌菌株的ITS序列片段大小均在600 bp左右，滿足測序要求(經過0.008 μm陶瓷膜處理后泡菜汁菌含量濃度較低，未能達到檢出限)。

2.4.2 Alpha多樣性分析

對不同孔徑陶瓷膜處理前后5個泡菜汁樣品的細菌和真菌進行Alpha多樣性分析，結果見表5。

表5 泡菜汁經不同孔徑陶瓷膜處理前后Alpha多樣性指數統計表Table 5 Alpha diversity index statistics of pickle juice before and after treatment with ceramic membranes of different pore sizes

由表5可知，4個樣品細菌和真菌覆蓋度指數均大于99%，表明泡菜汁中微生物多樣性組成且序列99%被檢出。根據ACE與Chao1值可知泡菜汁中群落豐富度指數，根據ACE預估泡菜汁中群落OUT數目，根據Chao1指數預估泡菜汁中物種總數。由ACE與Chao1值可知，泡菜原汁中的細菌及真菌物種總數最大，經0.5 μm陶瓷膜處理后泡菜汁次之，其次是0.2 μm，0.05 μm物種總數最少。Shannon和Simpson指數表征群落內物種分布的多樣性和均勻度，Shannon或Simpson指數越大，物種分布的多樣性和均勻度越高，即群落的物種多樣性越高。經陶瓷膜膜處理后，Shannon和Simpson指數下降,且陶瓷膜孔徑越小Shannon和Simpson指數越小。泡菜原汁物種多樣性和均勻度顯著高于經陶瓷膜處理后的泡菜汁。

2.4.3 細菌和真菌結構相似性分析

在多元統計分析中，主成分分析PCA(principal component analysis)是一種簡化數據集的技術。主成分分析經常用于減少數據集的維數，同時保持數據集中對方差貢獻最大的特征，從而有效地找出數據中最主要的元素和結構，揭示隱藏在復雜數據背后的簡單結構(R軟件)。由圖5可知，樣本間相似度越高則在圖中越聚集。4個樣品中基于細菌、真菌的OTU做PCA分析。采用PCA對陶瓷膜過濾前后泡菜汁中細菌和真菌群落結構的相似性進行分析，結果見圖5，細菌第一主成分方差貢獻率和第二貢獻率分別為63.48%和33.59%，兩個主成分覆蓋泡菜汁樣品中細菌97.07%的OTU差異。原泡菜汁與0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁距離較遠，表明經過0.05 μm陶瓷膜處理后細菌群落結果差異較大，而原泡菜汁與與0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁樣品聚集到一起，說明原泡菜汁0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁細菌群落組成最相似，其次是0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁。真菌第一主成分方差貢獻率和第二貢獻率分別為61.08%和22.7%，兩個主成分覆蓋泡菜汁樣品中真菌83.78%的OTU差異。原泡菜汁與0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁距離較遠，表明經過0.05 μm陶瓷膜處理后真菌群落結果差異較大，而原泡菜汁與0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁樣品聚集到一起，說明原泡菜汁與0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁真菌群落組成最相似，其次是0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁。

2.4.4 細菌和真菌群落多樣性

分別從域、門、綱、目、科、屬這6個水平對5個樣品進行細菌群落、真菌群落分析。

在門分類水平上，原泡菜汁及經過不同孔徑陶瓷膜處理泡菜汁細菌的分類情況見圖6中(a)，其中厚壁菌門(Firmicutes)在原泡菜汁、0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁中占優勢，豐度分別為44.41%、66.35%、98.38%、99.36%；變形菌門(Proteobacteria)在原泡菜汁、0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁中占優勢豐度分別為21.59%、18.56%，0.2 μm和0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁未檢測到；Actinobacteriota在原泡菜汁、0.5，0.2，0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁中豐度分別為7.47%、6.25%、0%、0%；Bacteroidota在各個樣品中的豐度分別為2.64%、3.9%、1.42%、0%；綠彎菌門(Chloroflexi)在各個樣品中的豐度分別為11.87%、0.54%、0%、0%； Gemmatimonadota在各個樣品中的豐度分別為5.43%、0.03%、0%、0%；而擬桿菌門(Bacteroidota)、Myxococcota和Acidobacteriota經陶瓷膜處理后均未檢測到。He等[30]采用高通量測序技術對發酵酸菜中的微生物研究發現，發酵酸菜的優勢菌為厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，與本文結果相一致。

在屬水平上，原泡菜汁及經過不同孔徑陶瓷膜處理泡菜汁細菌的分類情況見圖7中(a)，其中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)在原泡菜汁、0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁中占優勢，豐度分別為48.25%、70.89%、80.24%、95.02%；芽孢桿菌屬(Bacillus)在各個樣品中豐度分別為21.3%、18.69%、13.25%、2.98%；短波單胞菌屬(Brevundimonas) 在各個樣品中豐度分別為10.9%、7.2%、4.8%、1%；Pseudomonas在各個樣品中豐度分別為2.56%、1.02%、0.5%、0.3%；Weissella在各個樣品中豐度分別為2.01%、1.32%、0.6%、0.2%；Brevundimonas和黏液乳桿菌屬(Limosilactobacillus)僅在原泡菜汁中檢測出。Peng等[31]通過傳統生物學培養方法和高通量測序發現發酵蔬菜中主要的優勢菌群為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。Pardali等[32]研究發現，自然發酵的蘿卜泡菜發酵后期主要優勢菌為植物乳桿菌，且有短乳桿菌被檢出，與本文結果相一致。

在門水平上，原泡菜汁及經過不同孔徑陶瓷膜處理的泡菜汁真菌的分類情況見圖6中(b)，其中子囊菌門(Ascomycota)在原泡菜汁、0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁占優勢，豐度分別為70.93%、76.9%、82.01%；擔子菌門(Basidiomycota)在各個樣品中分別占23.99%、20.1%、17.85%；毛霉門(Mucoromycota)在各個樣品中分別占3.69%、2.1%、0%。經0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁中未檢測出真菌。Chen等[33]研究泡菜發酵中有子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)等真菌的存在。

圖6 不同孔徑的陶瓷膜處理后泡菜汁中細菌(a)和真菌(b)在門水平群落組成 Fig.6 The compostion of bacterial (a) and fungal (b) community in pickle juice treated with ceramic membranes with different pore sizes at the phylum level

在屬水平上，原泡菜汁及經過不同孔徑陶瓷膜處理的泡菜汁細菌真菌分類情況見圖7中(b)，畢赤酵母屬(Pichia)在原泡菜汁、0.5 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁、0.2 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁豐度分別為40.9%、31.5%、25.8%；鎖擲孢酵屬(Sporidioboluspararoseus)在各個樣品中占比分別為28.6%、39.9%、60.2%；擲孢酵母屬(Sporobolomycescarnicolor)在各個樣品中占比分別為26.8%、25.4%、12.7%，曲霉屬(Aspergillus)、Saccharomyces和Issatchenki僅在原泡菜汁中檢出。Guan等[34]對廣西酸筍和廣西泡菜中的微生物多樣性研究發現優勢真菌為酵母菌，與本文泡菜中的優勢菌結果相一致。

圖7 不同孔徑的陶瓷膜處理后泡菜汁中細菌(a)和真菌(b)在屬水平群落組成 Fig.7 The compostion of bacterial (a) and fungal (b) community in pickle juice treated with ceramic membranes with different pore sizes at the genus level

采用高通量測序技術，經過0.008 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁未檢測到微生物。經過0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中的細菌大部分被截留，從門水平上包括Actinobacteriota、Myxococcota、Gemmatimonadota、Chloroflexi、Bacteroidota和Acidobacteriota，從屬水平上包括Limosilactobacillus、Brevundimonas；真菌被截留，從門水平上包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和毛霉門(Mucoromycota)，從屬水平上包括畢赤酵母屬(Pichia)、鎖擲孢酵屬(Sporidioboluspararoseus)、擲孢酵母屬(Sporobolomycescarnicolor)、曲霉屬(Aspergillus)、Saccharomyces和Issatchenki。

采用傳統微生物學培養方法，經過0.008 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁，未能成功分離鑒定出微生物。經過0.05 μm陶瓷膜處理后，泡菜汁中的細菌大部分被截留，包括蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、嬰兒芽孢桿菌(Bacillusinfantis)、蟬桿菌(Bacillusciccensis)、放線菌(Actinobacteriabacterium)、馬賽短芽孢桿菌(Brevibacillusmassiliensis)、橙色短波單胞菌(Brevundimonasaurantiaca)、堀越氏芽孢桿菌(Bacillushorikoshii)、Bacillusgottheilii、Brevundimonascaseigenomic、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)及絲狀芽孢桿菌(Bacillusfilamentosus)；真菌分別是謝瓦曲霉(Aspergilluschevalieri)、卡尼克酵母菌(Sporobolomycescarnicolor)、鎖擲孢酵母菌(Sporidioboluspararoseus)和庫德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。

3 結論

通過傳統培養方法和高通量測序技術結合較真實、全面地分析不同孔徑陶瓷膜處理對泡菜汁中微生物截留的種類的差異性及菌相的變化。結果顯示：經不同孔徑陶瓷膜處理后，泡菜汁中細菌和真菌的多樣性降低，膜孔徑越小微生物被截留的效果越好。泡菜汁中細菌和真菌群落組成差異性較大， 孔徑為0.008 μm 和0.05 μm的陶瓷膜對微生物有良好的截留作用。0.05 μm陶瓷膜處理后的泡菜汁雖然有微生物檢出，但都是乳酸菌以及一些本身無毒、無害、無污染且具有一定抑菌效果的細菌，而且0.05 μm陶瓷膜的膜通量遠遠高于0.008 μm陶瓷膜。綜上所述，可選擇0.05 μm 陶瓷膜應用于泡菜汁的膜處理。