霉魚生產過程中品質特性變化研究

劉旭坤，趙 利*

(1.江西科技師范大學生命科學學院，330013，南昌；2.江西省水產加工及安全控制研究中心，330013，南昌)

0 引言

傳統自然發酵霉魚風味獨特、咸香適口，極具地方特色，是江西吉安撫州一帶的特色美食。霉魚的主要原料是鳙魚塊、辣椒粉和鹽，經過晾干、腌制，在室溫下厭氧發酵直到形成典型的香味[1-4]。加工過程中霉魚的品質變化涉及肌肉組織中多種物質的氧化、合成、降解、相互作用等。蛋白質作為原料的主要化學成分，在加工中通過水解、氧化、產物互作等多種途徑影響發酵和成熟過程中產品的風味、色澤和質構[3]。

通常在發酵10 d左右即可得到具有傳統風味的霉魚產品，然后一直處于油浸密封狀態下繼續發酵保藏，食用周期可至3個月甚至半年之久[4-5]。霉魚現多由作坊加工生產，還未出現完善的企業標準。霉魚在發酵保藏期間，可能會發生質地、風味品質改變，導致出現安全性問題。評價其品質和安全性顯得尤為重要。本研究以不同加工階段的霉魚為研究對象，通過微生物、物理、化學以及感官4種評價方法以綜合評價霉魚在不同加工階段的品質變化，并對蛋白質在加工過程中的結構間的變化及這些變化對品質的影響進行了深入研究，為尋找合理的發酵保藏時段及探究霉魚的品質變化機理提供一定的理論依據，為霉魚的安全食用及工業化生產提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮鳙魚：購自江西南昌樂買佳超市；三氯乙酸；乙醇；甲醛；三氯甲烷；亞鐵氰化鉀；硫氰酸銨；氯化亞鐵；乙二胺四乙酸二鈉；硫代巴比妥酸：化學試劑均為分析純；平板計數培養基(PCA)；孟加拉紅瓊脂；結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRGBA)。

1.2 儀器與設備

CT3-4500質構儀：美國Brookfield公司；Color i7色差儀：美國Xrite公司；TGL-16G高速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 霉魚制備與樣品處理 鮮鳙魚洗凈，去鱗、內臟，在20 ℃條件下懸掛晾制2 d，除去部分水分，直至魚皮皺縮，魚肉水分含量達到60%，切成2 cm大小的魚塊，加入2%姜絲、5%酒精含量50%的白酒，4 ℃下腌制1 d，樣品均勻沾裹3%鹽和3%辣椒粉混合物，放置于玻璃罐中，加入菜籽油，油浸樣品，放置于室溫(28～32 ℃)中發酵，分別在發酵15 d、30 d、45 d、60 d、75 d取樣。

1.3.2 實驗方法

1)基本營養成分測定。蛋白質含量采用《GB5009.5—2010》凱氏定氮法測定；脂肪含量參照《GB 5009.6—2016》索氏抽提法測定；水分參照《GB5009.3—2010》中直接干燥法測定。

2)色澤測定。使用分光測色儀測定魚塊的亮度值L*、紅綠值a*以及藍黃值b*。其中L*為亮度值，L*值越大則樣品光澤度越好，a*值越大樣品越紅，反之越綠，b*值越大則樣品越黃，反之越藍。

3)ATP質構分析。肉塊切成厚度1.5 cm進行質構分析[6]。質構儀選擇ATP模式測定，探頭選擇TA25/1000，壓縮距離5 mm，數據頻率50點/s，循環2次，每個樣品測3組平行。

4)pH值的測定。采用《GB/T9695.5—2008》方法測定。

5)TVB-N值測定。采用《GB 5009.228—2016》方法測定。

6)亞硝酸鹽測定。采用《GB 5009.33—2010》方法測定。

7)POV值的測定。參考Wang方法[7]，有所改動。取2.00 g樣品加入15 mL三氯甲烷甲醇混合液(2:1)和3 mL 0.5%NaCl均質1 min，震蕩5 min，后以3 000 r/min離心5 min。取下層清液5 mL加入5 mL三氯甲烷甲醇混合液，一滴硫氰酸銨一滴氯化亞鐵，反應5 min后于500 nm處測吸光度(A500)。

8)TBARS值的測定。取10.00 g樣品加入50 mL 7.5%三氯乙酸溶液(內含有0.1%EDTA)，分散機分散后震蕩30 min，雙層濾紙過濾。取5 mL濾液加入5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液，90 ℃反應40 min，取出室溫下冷卻，加入5 mL三氯甲烷，渦旋1 min靜置分層。取上層液體分別于波長532 nm(A532)以及600 nm(A600)處測吸光度，計算TBARS值[8]。

式中：155為丙二醛摩爾吸光系數，72.6為其相對分子質量。

9)微生物測定。菌落總數使用《GB 4789.41—2016》方法測定。腸桿菌使用《GB 4789.41—2016》方法測定。

10)肌原纖維蛋白及肌漿蛋白的提取。稱量樣品3.0 g，加入10倍體積的緩沖液A(0.02 mol/L磷酸緩沖溶液，pH6.5)在分散機1 500 r/min條件下分散10 min，4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，上清液在15 000 r/min離心5 min，上清液為肌漿蛋白。取沉淀加入緩沖溶液B(0.1 mol/L pH6.5磷酸緩沖溶液，其中含 0.7 mol/L KI)分散機1 500 r/min條件下分散10 min，13 000 r/min離心15 min，上清液為肌原纖維蛋白，以雙縮脲法測蛋白濃度[9]。

11)蛋白氧化指標的測定。1 mL蛋白溶液中加入1 mL 10 mmol/L DNPH(以2 mol/L HCl溶解)，渦旋混勻，溶液37 ℃下保溫1 h，加入1 mL 20%三氯乙酸后渦旋30 s，10 000 r/min離心5 min，沉淀用乙酸乙酯乙醇混合液(溶液體積比1:1)洗至無色，加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液在37 ℃下保溫20 min，沉淀溶解后10 000 r/min離心5 min，上清液在370 nm處測吸光度，計算羰基含量[10]。

1 mL蛋白溶液加入9 mL 0.2 mol/L緩沖溶液(含有8 mol/L尿素，2%SDS，10 gEDTANa2，pH6.8)混勻，取4 mL混合液加入0.4 mol 0.1%DTNB(0.2 mol/L緩沖溶液，pH8.0溶解)渦旋混勻，40 ℃中保溫25 min，412 nm處測吸光度，計算巰基含量。

12)感官評價。邀請10位經專業培訓的同學，對不同發酵階段的霉魚進行感官評價，評價從色澤、氣味、質地、滋味(蒸熟)幾個方面進行。評分標準如表1所示。

表1 感官評價標準表

1.3.3 數據處理 結果以平均值±標準差表示，使用Origin作圖，SPSS22進行單因素方差方分析、相關性分析。P<0.01 表示極顯著，P<0.05 表示顯著。

2 結果與分析

2.1 不同加工階段霉魚基本營養成分變化

由表2可知，樣品中水分、蛋白質、脂肪含量在加工過程中變化顯著(P<0.05)，蛋白質和脂肪在發酵過程中呈下降趨勢，說明蛋白質和脂肪在發酵過程中發生了降解，蛋白質降解由魚體內的內源性蛋白酶以及微生物產生的蛋白酶誘導形成低分子量化合物，如肽、氨基酸、醛、有機酸，從而影響產品的質地和風味。發酵過程中脂解釋放的游離脂肪酸經過氧化產生醛和酮，更能促進發酵產品的典型風味形成[2]。水分在干燥和腌制過程中降至63.88%，發酵后有所回升并維持在69%～71%，可能是由于添加的白酒等腌料的水分影響。由于添加了3%的食鹽利于水分析出，水分含量下降；pH值下降，魚肉蛋白發生氧化和降解變化劇烈，使得魚肉纖維變的緊密；同時，油封密閉環境，水分難以蒸發，發酵過程中水分含量變化較小。

表2 不同加工階段霉魚基本成分變化(g/100g濕基)

2.2 物理特性變化與霉魚品質評價

2.2.1 質構(TPA)特性變化 TPA測試中各項指標可以反映霉魚的感官品質和蛋白脂肪等主要成分變化。霉魚在加工過程中質構特性變化見表3，咀嚼性與彈性、內聚性以及硬度有關，咀嚼性的變化是霉魚品質變化的重要指標之一。在霉魚各加工階段，咀嚼性變化顯著(P<0.05)，在F3階段達到最高值，分別是R的5.5～6.8倍，可能是由于鹽和發酵產酸共同作用使得蛋白變性導致酸凝膠化加劇，形成霉魚的特征質構。內聚性在腌制階段降低至0.52可能由于加入腌料破壞了樣品內部結合鍵強度，發酵階段內聚性增加顯著可能由于pH值下降引起的內部結合鍵強度升高[11-12]。

表3 不同加工階段霉魚的質構特性變化

2.2.2 不同加工階段霉魚色澤的變化 色澤是影響消費者對產品喜好程度的重要指標之一。霉魚在不同加工階段中色澤變化如表4所示，干燥(D)和腌制(S)過程中L*、a*和b*值變化不顯著，在發酵過程中均變化顯著(P<0.05)，色度值變化可能與水分變化有關，隨著樣品水分含量下降則L*值升高，a*值隨之減小，b*值升高[13-14]。此外顏色變化也與脂肪氧化、蛋白氧化相關[15]。

表4 不同加工階段霉魚的色差變化

2.3 化學特性變化與霉魚品質評價

2.3.1 不同加工階段對霉魚pH值的影響 由圖1可知，pH值整體呈下降趨勢，可能由于微生物活動消耗碳源，代謝產物累積，總酸含量升高，F1發酵階段迅速下降，F2、F3、F4發酵階段變化不顯著，pH下降導致蛋白酸變性和聚集，從而影響霉魚口感，可能也會影響內源蛋白酶及微生物酶的水解作用，變化不顯著可能與所產生的有機酸的緩沖能力有關。發酵后期pH值上升可能與內源性或微生物酶產生的氨等降解產物或揮發性堿化合物的形成有關[16]。

圖1 不同加工階段霉魚的pH值變化

2.3.2 不同加工階段霉魚TVB-N值變化 不同加工階段霉魚的TVB-N值變化如圖2所示。TVB-N含量在加工過程中呈不斷上升趨勢，在干燥(D)、腌制(S)階段變化不顯著，發酵階段變化顯著(P<0.05)。在F1階段，TVB-N值略高于國家TVB-N 的一級淡水魚鮮度(≤15 mg/100g)；繼續發酵，TVB-N含量持續上升，F3至F4階段增長迅速，在F4階段其含量達34.65 mg/100g，超出國家TVB-N二級鮮度限值(≤25 mg/100g)。在F1、F2和F3階段TVB-N增長緩慢可能是由于pH值較低，發酵產生的抗菌素中和了一部分TVB-N。如果以歐盟訂立的TVB-N在魚肉中不得高于35 mg/100g標準為參考[17]，則霉魚以發酵方式保藏的可食用時間不超過60 d(F4)，但這還需與其它指標結合綜合判斷。TVB-N值變化趨勢與林城杏酸魚一致[18]。

圖2 不同加工階段霉魚的TVB-N值含量變化

2.3.3 發酵時間對亞硝酸鹽含量的影響 發酵過程中霉魚亞硝酸鹽含量的變化見圖3，發酵過程中霉魚亞硝酸鹽含量均遠低于國標規定的安全標準(≤30 mg/kg)， 符合國家食品衛生標準。F1、F2階段亞硝酸鹽增長較為緩慢，可能由于酸性條件下亞硝酸鹽易被降解[19-20]。這結果與沈穎瑩發酵魚成品亞硝酸鹽含量相似[21]。

圖3 不同發酵時段霉魚亞硝酸鹽含量的變化

2.3.4 不同加工階段對霉魚脂質氧化程度的影響 脂肪氧化對肉的品質起決定性的影響。脂肪氧化對肉的影響有3個方面。首先是安全性，二級脂質氧化產物對人體有毒性；其次是生物利用度方面，必需脂肪酸的氧化會降低營養價值；最后會影響感官質量，風味和顏色發生了不期望的變化，出現特征劣變氣味，顏色變黃[22]。

霉魚加工過程中脂質氧化情況，以POV和TBARS值表示(圖4)。POV值與TBARS值變化趨勢基本一致，總體呈上升趨勢。POV值通常被認為是初級脂質氧化產物，在加工過程中總體呈上升趨勢，干燥樣品的POV為0.020 6 mg/kg，與新鮮樣品的POV無顯著差異(P>0.05)。在腌制階段(S)時達到第一個峰值即0.226 mg/kg，并在這之后的發酵階段下降，而在發酵第60 d(F4)時升至0.382 mg/kg，其原因可能是初級氧化產物進一步氧化形成低分子形式的二級脂質氧化產物，如醛或酮等，同時氧化產物又不斷累積，因此POV值在發酵階段又重新升高[23]。

TBARS值是反映相對極性二級反應產物濃度的良好指標，特別是醛，是肉類產生異味的主要原因[24]。TBARS值在S階段升至峰值達到1.203 7 mg/100g后又迅速下降，可能是形成的部分丙二醛與蛋白質水解的產物游離氨基酸發生反應或者醛類物質進一步氧化成有機醇和羧酸等小分子物質造成的。在發酵過程中TBARS值整體呈上升趨勢，F2至F5階段TBA值增長變緩，可能是因為微生物在該發酵階段生長過程中產生較多過氧化氫酶，從而抑制肉制品中脂肪變質，或醛類物質自身或與其他化合物發生了反應，所以TBARS值增長趨勢變緩[25-26]。該研究結果與趙珠蓮等研究發現發酵肉制品脂肪氧化趨勢相同[27]。

圖4 不同加工階段霉魚的TBARS值、POV值變化

2.4 不同加工階段霉魚中微生物的變化

發酵過程中微生物的存在有助于蛋白質的降解以及風味和香氣的形成[28]。以鳙魚為原料的初始菌落總數為5.34 lgCFU/g，在干燥期間空氣中的菌落附著，菌落總數升高至6.59 lgCFU/g。經過腌制處理后略有下降(P<0.05)。室溫發酵時，菌落總數持續升高(P>0.05)，發酵15 d后，菌落總數達到7.49 lgCFU/g，后開始出現小幅下降，但在F4到F5階段后其含量又有所回升。在加工過程中，鹽通過抑制腐敗和致病微生物的生長，在保存中起著關鍵作用。腌制和干燥過程導致魚肉的水分含量和pH值降低，這些條件有利于抑制腐敗菌生長[29]。腸桿菌主要包括沙門菌屬、志賀氏菌、大腸桿菌，是霉魚發酵保藏過程中主要控制的致病菌。腸桿菌含量在發酵初期顯著下降，可能由于微生物的基數已經處于很高水平，同種微生物之間亦存在生存空間的競爭。F3到F5階段，腸桿菌數量上升至3.49 lgCFU/g，可能由于pH值上升，對腸桿菌產生的抑菌作用消失。參考霉豆腐腸桿菌標準《GB 2712—2014》和《GB 29921—2021》發酵魚標準，在整個發酵過程中F1、F2和F3腸桿菌含量符合衛生標準(<31 000 CFU)。

圖5 相關微生物含量的變化/(lgCFU/g)

2.5 不同加工階段中蛋白質氧化規律

如圖6所示，加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量變化均顯著降低(P<0.05)，在發酵階段蛋白含量下降顯著，肌原纖維蛋白在發酵75 d(F5)時降至7.18 mg/g，肌漿蛋白降至18.83 mg/g，分別是鮮肉(R)的9.16%和33.66%，可能是由于水分含量降低，pH值下降導致組織蛋白酶被激活，微生物酶協同水解魚肉蛋白[24]。

蛋白羰基、巰基的含量可以反映蛋白的氧化程度[30]。加工過程中蛋白質羰基和巰基含量變化如圖7所示。霉魚加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的羰基含量顯著上升(P<0.05)，分別由鮮魚的6.8 nmol/mg和3.07 nmol/mg，增長至19.17 nmol/mg和12.24 nmol/mg。羰基化合物的形成主要分為直接作用和間接作用，直接作用主要為賴氨酸、脯氨酸、蘇氨酸等側鏈直接氧化和肽主鏈的直接斷裂，間接作用主要為還原糖的非酶催化反應即美拉德反應以及非蛋白羰基化合物如丙二醛共價結合、4-羥基-2-壬烯醛等[31]。

加工過程中巰基含量顯著下降(P<0.05)，F5階段肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的巰基含量僅為鮮肉的20.62%、17.61%。巰基含量的降低可能是由于氧化破壞了蛋白質空間結構，使巰基轉化為分子之間、分子內二硫鍵或氧化成次磺酸，亞磺酸和磺酸，也可能是存在疏水相互作用等導致蛋白變性聚集，從而導致能檢測到的巰基含量降低[31]。在加工過程中蛋白質表面的巰基被氧化，形成二硫鍵或二硫鍵發生-S-S-互換作用，使蛋白質與水分結合的能力減弱，導致了持水能力的降低，對產品品質產生間接影響[32-33]。此研究結果與曹辰辰等研究發酵香腸蛋白質巰基含量隨時間變化的趨勢相同[34]。

圖6 不同加工階段霉魚肌原纖維蛋白和肌漿蛋白含量變化

圖7 不同加工階段霉魚羰基和巰基含量的變化

2.6 發酵時長對霉魚感官品質的影響

F5階段TVB-N值超出標準，僅對發酵保藏的F1～F4階段進行感官評價。由表5可知，在發酵45 d前色澤更接近鮮肉，得分較高，F4階段色澤發黃暗淡，使得得分降低；組織形態評分隨發酵進行而肉塊變硬、組織松散，得分降低；氣味和滋味得分均是先增加后降低；F2達到最高，后續下降明顯。由感官評分可知F1、F2階段品質良好F3、F4稍次，均可被消費者接受。

表5 不同發酵階段霉魚的感官評價結果

3 結論

本研究證實了霉魚加工過程中品質變化及蛋白質氧化。蛋白質變化對霉魚品質具有相關性，對霉魚品質指標，如質構、色澤等，在發酵前期均產生積極作用。與新鮮魚肉相比，霉魚加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白均發生顯著降解，蛋白質、脂肪氧化持續加深；品質分析表明霉魚硬度、咀嚼性、彈性升高增加了產品質構品質；加工中蛋白質持續氧化顯著影響產品色澤的形成過程；蛋白質、脂肪氧化顯著影響產品感官評分。在加工過程中各項化學指標、微生物指標均符合食品安全標準，結合感官評價，霉魚發酵保藏最佳食用時間為30 d，發酵保藏最長時間為60 d。