天然產物的合成生物學研究

葉少杰 秦嘉豪 路斯博 魏岱旭

合成生物學是21世紀誕生的一門交叉學科，它結合了傳統的生物工程和系統生物學概念，旨在建立人為設計的生物系統，即將基因連接成網絡，利用宿主細胞（底盤細胞）完成設想的相關任務，具體過程一般包括底盤細胞的構建、合成元件的挖掘與采用、合成途徑的設計以及細胞合成工廠的創建。由于微生物具有代謝速率高、培養條件易控制、可通過生化反應器放大其規模等諸多優點，所以目前普遍將微生物作為底盤細胞。

利用合成生物學技術生產目的產物具有高效、經濟、環境友好等一系列優點，因此，運用該手段針對各種化學品、新型非天然藥物、天然產物等的研發與應用正在如火如荼地展開。有研究團隊利用轉錄組和代謝組的關聯分析，確定并全面解析了黃芩素的整個生物合成途徑，再用生物合成技術生產產品[1]；有研究人員以嗜鹽單胞菌為研究對象，實現了聚羥基脂肪酸等高分子材料、化學品和燃料的生物制造，其可應用于醫療、環境等領域[2-5]；另有研究團隊長期以深海、極地等極端環境的微生物和動植物共生生物為研究對象，克隆并鑒定了多種抗生素的基因簇，開展關于非天然抗生素藥物的合成生物學研究，獲得了大量新型的抗生素衍生物，推動了我國微生物藥物生物合成領域的發展[6]；還有實驗室利用邏輯門的概念（指具有與計算機所用電路邏輯門類似信息處理能力的基因線路組件），成功設計并構建了基因線路，實現了對于膀胱癌細胞的識別和治療[7]。合成生物學的不斷發展和完善為能源、材料、醫療、食品、日化等行業提供了更多的產品支撐。

結構多樣的天然產物

天然產物具有很好的生物學活性，廣泛應用于醫藥、食品、香料、化妝品等方面。然而，從植物或動物本身提取天然產物的步驟十分煩瑣，且收益低，同時由于其結構復雜，利用化學合成天然產物也會帶來很大的困難，因此生物合成法就成為一個值得考慮的新方法。

萜類化合物

萜類化合物是自然界廣泛存在的一大類異戊二烯衍生物，主要從植物、微生物及海洋生物中分離得到。萜類通式是 （C5H8）n（n是異戊二烯的單元數）。其目前已鑒定得到的種類有55 000多個，占所有天然化合物的60%[8]。

萜類不但具有廣泛的抗癌功效[9]，還有消炎、降糖等藥理作用。三萜皂苷類能夠消炎、抗過敏、抗病毒、降血糖、治療白血病，以及防治心腦血管等疾病[10]。此外，很多植物源萜類化合物是芳香性揮發性物質，被廣泛應用于香料、香水、調味劑及化妝品等行業[11]。萜類結構的多樣性還使其成為汽油、柴油等燃料的高級替代物。例如單萜蒎烯、檸檬烯、半萜異戊烯醇、異戊醇等均是公認的燃料及燃料的前體物。

萜類在植物中的含量通常很低，且植物提取法還存在野生資源稀缺、分離效果不佳、產量極低的問題?；瘜W合成法雖解決了植物提取法中的諸多問題，但仍存在原料昂貴、工藝流程復雜、立體選擇性低、污染大、總收率偏低等問題。而生物合成法則不受原料的限制，具有生產過程綠色清潔、產物單一、產率提升空間大等優勢。生物合成法有兩種，一種是通過代謝工程手段直接在植物中促進萜類化合物的合成，然而由于植物生長緩慢且體內代謝過程錯綜復雜，所以這種萜類合成方法面臨著目標產物產量有限、后期分離困難、生產周期長等問題；另一種是通過合成生物學的方法在微生物等底盤細胞中合成目標產物。目前，對于萜類合成生物學的設計策略一般可以分為兩部分：一是底盤細胞的選擇及改造；二是萜類合成途徑的挖掘。

底盤細胞的選擇及改造是實現合成生物學方法用以生產萜類化合物的基礎。選取不同的底盤細胞對于萜類的生物合成有關鍵性的影響，例如大腸桿菌主要用于酮、醇、酸等化學品而非萜類的生物合成。另外，由于細菌缺少翻譯后修飾而難以表達細胞色素，且很多萜類化合物具有抗細菌活性，因此多采用釀酒酵母等真核生物進行萜類的生物合成。利用酵母細胞的好處是酵母能夠直接合成較多的二甲基丙烯基二磷酸和異戊烯焦磷酸，從而為萜類合成提供大量的前體物。其優勢有三點：一是選用酵母作為底盤細胞可以通過酵母基因組的必需基因分析，保留最小基因組，從而在萜類的生物合成過程中減少其內源消耗；二是所有基因工程操作都可以通過染色體融合完成，這樣可以保證酵母工程菌株的遺傳穩定性；三是可以通過對酵母細胞進行耐高溫、耐酸、耐鹽等抗逆改造。

萜類合成途徑的挖掘是從自然中尋找合適的萜類化合物生成與表達的相關基因，并將其加入人工設計的基因表達系統內，從而直接或間接實現對萜類物質的生物生產流程的優化或創造。無論何種產物，其相關合成途徑的挖掘是合成生物學快速發展的保障。隨著全基因組測序、第二代 DNA 測序技術以及宏基因組學技術的發展，越來越多的天然產物代謝途徑被挖掘出來，并且植物萜類化合物的合成往往伴隨著基因表達簇結構的發現。隨著對異源基因的密碼子優化、啟動子終止子的選取和搭配組合優化、合成途徑的標準化組裝、發酵條件摸索及發酵工藝優化等方面的深入研究，萜類合成關鍵酶的異源高效表達以及萜類的合成能力已經得到了很大的提高。

當前通過對萜類的生物合成途徑的鑒定研究，設計開發出越來越多的組合調控萜類合成途徑的功能模塊，并在底盤細胞中創建合成工廠，已可實現萜類的體外合成。因此，合成生物學的發展為實現微生物發酵生產萜類提供了有力的支撐。

生物堿

生物堿是一類含負電荷氮離子的、具有環狀或非環狀結構的次生代謝產物，廣泛存在于諸多生物分泌物中。植物界中的罌粟科、豆科、蘭科以及麻黃科等普遍會分泌生物堿；動物界中有蟾蜍分泌的蟾蜍堿、麝香中的麝香吡啶、加拿大海貍香腺中的海貍堿等。生物堿普遍具有抗菌、抗癌、鎮痛等作用，也是當今抗腫瘤、心血管疾病相關藥物研發生產的重要資源。然而，由于植物生長緩慢且體內生物堿含量較低，無法滿足市場需求。因此用合成生物學的方法實現生物堿的規模化生產是很好的方法。

青蒿素是我國發現的第一個被國際公認的抗瘧首選天然藥物，其結構為含過氧橋基團結構的倍半萜內酯類化合物。眾多科研人員通過接力式的研究，先后實現了將青蒿中的紫穗槐-4， 11-二烯合酶在酵母中過表達（實現了青蒿素合成前體紫穗槐-4， 11-二烯的合成）、啟動子和代謝流優化、整合細胞色素酶、脫氫酶，再通過添加過程代謝物等手段，目前已使得酵母中青蒿酸的含量達到 25 克/升，初步達到工業化生產水平?？梢哉f，青蒿素是目前利用合成生物學技術實現產業化最為成功的典范之一。然而，實現低成本工業化生產青蒿素等眾多生物堿的探索道路仍然任重道遠。

目前，利用合成生物學手段實現實際社會生產中的天然產物合成仍然存在著諸多挑戰。例如原核表達系統、細胞內無高級細胞器、缺乏轉錄后修飾，而酵母作為真核表達系統必須人為地將內含子從蛋白質編碼序列中刪除。越來越多的生物技術，如構建基因庫、蛋白質工程、高通量篩選以及 CRISPR/Cas9 基因編輯技術等的發明與應用可解決上述難題。這些不斷完善的新生物合成工具正隨著具有重要藥用價值的生物次生代謝物的生產成本與資源協調等相關問題的解決，逐步創造著更加可觀的未來。

參與生物合成的工具酶

天然產物的生物合成過程離不開一個關鍵物質——酶。對于我們人類自身來說，情緒波動、思維跳動、身體運動都離不開各種酶類。酶在各種生物體內含量雖微小但卻起著舉足輕重的作用。天然產物的合成更離不開它們。參與天然產物生物合成的這些酶類被稱為工具酶。顧名思義，就是合成天然產物的“工具”。主要包含途徑酶和后修飾酶[12]。

途徑酶

途徑酶，即合成天然產物相關生化反應途徑過程中的酶類，是由底物生成某種產物的先決條件。

氧化還原酶（催化氧化還原反應的一類酶）就是一大類關鍵的途徑酶，其在生物體的氧化產能、解毒以及某些生理物質形成等過程中起重要的作用，屬于第一大類酶，在生物界中存在且數量龐大。而在催化作用中，一般都需要輔酶或輔基參加，其通常可分為4個亞類：①脫氫酶，催化從底物上脫氫反應的酶；②氧化酶，催化底物脫氫，并把氫交給氧氣生成過氧化氫或水的酶；③過氧化物酶，催化以過氧化氫或其他過氧化物為氧化劑反應的酶；④氧合酶，催化氧原子直接參與有機分子反應的酶。

目前，天然產物的生物合成中主要的困難是氧化還原酶結構復雜，具有輔酶和底物等多個結合位點，且往往由多個亞基組成，因此在反應過程中容易失活。而提高氧化還原酶的穩定性主要有酶分子結構改造和固定化兩種途徑[13]。氧化還原酶的固定化需要在材料選取和固定化方法選擇方面，例如酶固定化載體的化學組成、界面性質以及微觀結構等對酶的穩定性、電子傳遞、底物和產物擴散過程的影響等多做考慮。目前廣泛使用的載體材料分為高分子材料、碳材料、聚合物—無機復合材料、金屬—有機框架材料等。這些材料具有穩定性好、機械強度高、化學惰性、孔隙率高、比表面積大等優勢，并可通過表面可控修飾獲得生物相容性好的固定化載體。

另外一大類途徑酶即限速酶。在天然產物的生物合成中，要想控制產率和產速，應從反應途徑入手。而調節反應途徑中對酶的調控在很大程度上是對限速酶的調控。如果把人體內的生化反應過程想象成道路上行駛的汽車，那么限速酶就如同限速攝像頭，超速行駛的車輛遇到攝像頭便會放緩速度，通過這樣的方式達到提高安全系數的目的。人體的基礎代謝，如糖酵解、糖異生、三羧酸循環中都有限速步驟，限速酶能夠影響反應的速度及進行與否。

后修飾酶

后修飾酶可以對天然產物進行結構修飾，豐富天然產物的結構多樣性，改善天然產物的性質，增加篩選獲得活性天然產物的概率。簡單來說，后修飾酶就是對途徑酶催化后的產物進一步優化，使其具有更強的效能。后修飾酶包括甲基轉移酶、酰基轉移酶、脂肪酶、氧化酶、糖基轉移酶和糖苷水解酶等。目前非常熱門的表觀遺傳學領域研究的就是環境因素導致生物的基因表達不同的問題?；虮磉_的不同與基因修飾密不可分，當然也就與后修飾酶密不可分了。如果我們把途徑酶比作一個熟練的工匠，那么后修飾酶就是精巧的刻刀，兩種酶之間只有熟練地配合，才能實現天然產物的生物合成。

合成生物學技術的新發展

構建大腸桿菌工程菌

研究者通?？蓞⒖忌锖铣商烊划a物的相關研究，尋找到天然產物合成中所需要的酶，并通過設計特異性引物，擴增獲得其DNA全長片段，然后用相應的限制性內切酶對其進行酶切，再用DNA連接酶將其插入載體獲得重組質粒。將獲得的重組質粒轉化到大腸桿菌中，并在對應的抗性平板上培養，利用各基因特異性引物進行菌落PCR，篩選驗證后構建大腸桿菌工程菌。

姜黃素是從姜科、天南星科等植物的根莖中提取的一種二酮類化合物，具有良好的抗炎和抗癌特性。在利用合成生物學方法合成姜黃素的研究中，研究者利用姜黃素生物合成關鍵酶β-酮酰輔酶A合酶基因和姜黃素合酶基因構建非天然融合基因，并將其與4-香豆酰輔酶A連接酶 和乙酰輔酶A羧化酶基因共同引入大腸桿菌中，構建合成姜黃素的大腸桿菌工程菌，進而實現姜黃素的大量生產。

CRISPR-Cas9基因編輯系統與核糖體工程

目前，在生物合成過程中，工程菌經過多輪的遺傳改造和誘變育種會產生新的基因，以至于難以通過抗性基因對其進行遺傳操作。而CRISPR-Cas9基因編輯技術不僅可以對靶向基因進行特定修飾，包括敲除、修復和替換等，同時還具有成本低、操作簡便、效率高、功能多樣等優點，因此近年來被廣泛應用于合成生物學、代謝工程和醫學研究等領域。

核糖體工程技術可對核糖體、RNA 聚合酶及轉錄因子進行修飾改造，進而提高次級代謝產物的生物合成。該方法常用靶向核糖體或RNA 聚合酶的抗生素來篩選抗性突變株。當得到的工程菌發酵水平無法達到工業水平時，可以通過核糖體工程技術來篩選出高產菌株，進而提高產量。

可利霉素是我國首次利用合成生物學技術研發的具有中國自主知識產權的一類新藥。合成可利霉素的工程菌因多次基因改造已獲得了兩種抗性基因，難以再進行基因改造。然而CRISPR-Cas9基因編輯技術可以通過向導RNA指導Cas9蛋白對靶基因進行剪切，然后完成對DNA的編輯，之后再通過核糖體工程技術篩選得到可利霉素的高產工程菌株。

截至目前，利用合成生物學方法合成天然產物已取得了一定的成果。然而在生物合成的過程中，工程菌的重構隨著基因簇的增大而變得愈發復雜，最后生成的產物也難以達到標準。因此，設計更好的基因編輯系統和構建更加適合的底盤細胞是未來發展的一個方向。

原始宿主的調控

對原始宿主的調控主要通過調控子（存在于基因旁側序列中，能影響基因表達的序列），以及改變代謝途徑中的加工酶或轉運酶等來增加天然產物的產量。

研究者在有關糖多孢紅霉菌TetR家族轉錄調控子SACE7301調控紅霉素產量的研究中，通過敲除SACE7301基因構建了ΔSACE7301突變體。在之后的對比實驗中發現，糖多孢紅霉菌中TetR家族轉錄調控子SACE7301可正向增加紅霉素的產量，但對糖多孢紅霉菌的形態分化影響不大。研究者進一步通過凝膠阻滯實驗發現SACE7301蛋白可在細菌體外與eryAI啟動子結合，進而推測SACE7301可能直接調控紅霉素的合成。

此外，在調控萜類合成途徑的基因表達，進而提高β-胡蘿卜素的產量時，研究人員將β-胡蘿卜素合成途徑基因導入大腸桿菌，并用多個調控元件對大腸桿菌甲基赤蘚糖醇磷酸途徑的7個基因和ispA基因進行調控。在此基礎上，進一步對dxr、ispG和ispH基因進行調控，同時對dxs和idi基因進行組合調控，將β-胡蘿卜素的產量提高了8倍。

基因表達的調控在天然產物合成方面獲得了很大的突破。目前，原始宿主內的調控主要集中在正向調控元件或生物傳感器的引入、負調控因子的刪除或沉默，從而實現未知基因簇的激活和過表達。因此，建立可通用的生物傳感器、發明快速準確的基因編輯手段是基于原始宿主調控天然產物合成產量的重要策略。

合成生物學對天然產物的實際生產將會產生顛覆式的影響。自合成生物學誕生至今的20多年來，其發展成果只是冰山一角，還有許多問題等待科研人員繼續挖掘和研究。合成生物學在化合物生產、組織醫療、食物生產、甚至是寵物娛樂行業都有理論上的應用，這是一門前沿的、將科幻變為現實的、應用型交叉學科，同時它帶來的相關社會倫理問題也需要進行深入討論。

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關鍵詞：合成生物學 天然產物 工具酶 大腸桿菌 ■