長(zhǎng)沙地區(qū)南瓜白粉病病原菌及種質(zhì)資源抗性的鑒定

嚴(yán)佳麗，楚 簫，黎 豪，梁少華，孫小武

（園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育教育部工程研究中心·湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 長(zhǎng)沙 410128）

南瓜是葫蘆科南瓜屬（）一年生蔓生草本植物，是我國(guó)重要的瓜類(lèi)作物，也是栽培最早的蔬菜作物之一，主要分為五大栽培種，即中國(guó)南瓜（.）、印度南瓜（.）、美洲南瓜（.）、黑籽南瓜（.）及灰籽南瓜（.）。南瓜具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值、飼用價(jià)值和觀(guān)賞價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，在我國(guó)廣泛種植。南瓜在我國(guó)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和經(jīng)濟(jì)增收中起到了重要作用。自20 世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著人們食物結(jié)構(gòu)的改善和對(duì)南瓜營(yíng)養(yǎng)成分及其保健價(jià)值的深入研究，南瓜種植面積逐年擴(kuò)大，南瓜生產(chǎn)過(guò)程中各種病害也逐年加重。白粉病是南瓜生產(chǎn)中的主要病害之一，白粉病具有潛伏久、發(fā)病快、蔓延迅速等特點(diǎn)，防治不當(dāng)，輕則減產(chǎn)20%～30%，重則造成植株死亡，嚴(yán)重影響南瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前，引起瓜類(lèi)白粉病的病原菌主要有3 個(gè)屬：白粉病菌屬（）、內(nèi)絲白粉病菌屬（）及單囊殼屬（），6 個(gè)種分別是.、.、.、.、.和.。.報(bào)道最多，其次為.。.已發(fā)現(xiàn)有11 個(gè)生理小種，分別是生理小種0、1、2US、2France、3、4、5、N1、N2、N3 和N4。

白粉病菌生理小種種類(lèi)繁多，分化快。不同作物之間的白粉病生理小種相差甚遠(yuǎn)，同一作物在不同地區(qū)栽培，白粉病生理小種也不盡相同。準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和鑒定南瓜白粉病病原菌種類(lèi)，并檢測(cè)其生理小種的分化是解決南瓜白粉病防治難題的基礎(chǔ)。2006 年劉秀波等對(duì)黑龍江地區(qū)侵染南瓜白粉病生理小種進(jìn)行了鑒定，確定其為單囊殼白粉菌（.），而2009 年馬鴻艷等研究表明該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)生理小種由2Frace 轉(zhuǎn)變?yōu)閞ace1。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的高速發(fā)展，基因序列比對(duì)等技術(shù)被應(yīng)用于物種鑒定等相關(guān)領(lǐng)域，白粉病病原菌的鑒定方式也由最初的顯微觀(guān)察向分子鑒定方向逐步發(fā)展。包海青等、王娟等、咸豐等利用顯微觀(guān)察和白粉病生理小種鑒別體系的方法分別對(duì)來(lái)自海南三亞地區(qū)、北京地區(qū)、陜西關(guān)中地區(qū)的南瓜白粉病菌進(jìn)行鑒定，確定白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（.），其生理小種是2France。屈淑平等、綦聰通過(guò)形態(tài)觀(guān)察、分子鑒定及白粉病生理小種鑒別體系的方法，鑒定出黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)南瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（.），生理小種為2France。李書(shū)頡等利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)內(nèi)蒙古不同地區(qū)籽用美洲南瓜白粉病病原菌種類(lèi)進(jìn)行鑒定，確定內(nèi)蒙古地區(qū)白粉病為單囊殼白粉菌（.），初步確定存在小種4、2F、1 和1 個(gè)未知小種；夏偉偉等通過(guò)形態(tài)觀(guān)察、ITS 序列比對(duì)以及生理小種鑒別體系推斷安徽省合肥市長(zhǎng)豐地區(qū)的南瓜白粉病為單囊殼病菌，生理小種是race1。

湖南作為南瓜的重要產(chǎn)區(qū)之一，目前關(guān)于湖南地區(qū)的南瓜白粉病鑒定和抗病種質(zhì)篩選的研究較少，筆者以湖南省長(zhǎng)沙地區(qū)為例，通過(guò)對(duì)湖南省長(zhǎng)沙市金山基地南瓜白粉病病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察、擴(kuò)增該白粉病病原菌ITS 序列并進(jìn)行比對(duì)，鑒定該地區(qū)的白粉病病原菌種類(lèi)；其次采用國(guó)際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主明確該地區(qū)的白粉病菌的生理小種，對(duì)90 份南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行白粉病抗性鑒定，篩選出高抗白粉病的種質(zhì)資源，為南瓜白粉病的抗病基因定位及培育抗白粉病新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2 份易感病自交系和90 份種質(zhì)資源鑒定材料由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院瓜類(lèi)工程技術(shù)研究中心和湖南雪峰種業(yè)有限公司提供。易感病自交系為新土佐父本（.Duch.）和蜜本（.Duch.），90 份南瓜種質(zhì)資源為36 份中國(guó)南瓜類(lèi)型和54 份印度南瓜類(lèi)型。2019 年4 月在長(zhǎng)沙市芙蓉區(qū)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)旁金山基地大棚種植南瓜自交系新土佐父本和蜜本，用于病原菌分離、鑒定及白粉病接種體系優(yōu)化，2019 年4 月在邵東縣九龍嶺鎮(zhèn)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)南瓜實(shí)驗(yàn)基地大棚種植90 份種質(zhì)資源鑒定材料，用于抗性鑒定。

國(guó)際通用鑒別寄主：Iran H、Top Mark、Védrantais、PMR 45、PMR 5、WMR 29、Edisto 47、PI 414723、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR 6、Nantais Oblong，由北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院張興平教授惠贈(zèng)。甜瓜鑒別寄主均在人工氣候箱中培養(yǎng)，用于白粉病生理小種鑒定。

白粉病病原菌取自2019 年4 月種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)南瓜試驗(yàn)基地自然發(fā)病的南瓜植株葉片。

1.2 方法

1.2.1 白粉病病原菌分離純化 2019 年5 月收集自然發(fā)病南瓜葉片白粉病單菌落，滴入2 滴吐溫20，制成2.5×10～5.0×10個(gè)·mL孢子懸浮液，噴施于南瓜健康幼苗植株葉片上，后置于28 ℃、濕度80%、光照度30 000 lx、光周期為12 h 的人工氣候箱中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)5 次分離純化后利用易感病品種新土佐父本植株擴(kuò)繁，活體保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 白粉病病原菌形態(tài)觀(guān)察 參照馬鴻艷等的方法，利用KOH 溶液觀(guān)察纖維狀體，取白粉病病原菌的分生孢子于載玻片上，滴加1 滴3% KOH 溶液，蓋上蓋玻片，在10×40 倍光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察白粉病孢子中是否存在纖維狀體。二孢白粉菌.的分生孢子呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，沒(méi)有纖維狀體。單囊殼白粉菌.的分生孢子呈橢圓形，有發(fā)達(dá)的纖維狀體。

1.2.3 白粉病病原菌分子鑒定 白粉病病原菌DNA 提取：用真菌DNA 小量提取試劑盒（天漠生物）提取白粉病病原菌的DNA。

ITS 序列PCR 擴(kuò)增引物與程序：利用真菌核糖體ITS 區(qū)段通用引物ITS 1、ITS 4，序列為：ITS 1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS 4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR 體系為50 μL 體系：DNA 模板1.25 μL，上下引物各2.5 μL，2×RapidMaster Mix（Vazyme）25 μL，ddHO 18.75 μL。PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃5 min；變性94 ℃30 s，退火50 ℃30 s，延伸72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃，10 min。

凝膠電泳檢測(cè)：取5 μL PCR 產(chǎn)物，核酸染料染色，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過(guò)瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察成像結(jié)果。

PCR 產(chǎn)物測(cè)序：將PCR 產(chǎn)物原液送至北京擎科生物有限公司進(jìn)行正反雙向測(cè)序。

序列分析：將南瓜白粉病病原菌ITS 序列在NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST 比對(duì)，使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。1.2.4 白粉病病原菌生理小種鑒定 采用國(guó)際通用的13 個(gè)甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主。通過(guò)寄主分析不同白粉病病原菌生理小種抗感反應(yīng)以區(qū)別本試驗(yàn)中感染白粉病病原菌的生理小種，寄主對(duì)不同生理小種抗感反應(yīng)表現(xiàn)見(jiàn)表1，每個(gè)鑒別寄主種植10 株。待寄主材料第3 片真葉展開(kāi)時(shí)即可接種，取分離純化后南瓜白粉病病原菌于清水中，滴加2 滴吐溫20，制成濃度為2.5×10～5.0×10個(gè)·mL的懸浮液，用毛刷蘸取菌液，均勻涂抹在寄主葉片正面。接種后保持晝/夜溫度26 ℃/16 ℃，相對(duì)濕度75%。接種后切忌在葉片上澆水，澆水和施肥從穴盤(pán)底部進(jìn)行。接種10 d 后調(diào)查發(fā)病情況，接種葉片出現(xiàn)白色分生孢子層的為感病；接種葉片無(wú)癥狀或出現(xiàn)褐色壞死病斑的為抗病。

表1 甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主及其抗感反應(yīng)

1.2.5 南瓜種質(zhì)資源白粉病抗性鑒定 2019 年6 月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)瓜類(lèi)工程技術(shù)研究中心邵陽(yáng)基地大棚中種植南瓜材料，在成株期對(duì)90 份南瓜種質(zhì)資源噴施濃度為2.5×10～5.0×10個(gè)·mL的白粉病孢子懸浮液，接種后15 d 對(duì)南瓜病情劃分等級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)計(jì)算結(jié)果判斷種質(zhì)資源抗性表現(xiàn)。鑒定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2，病情指數(shù)（DI）計(jì)算如下：

表2 植株抗感白粉病情況鑒定標(biāo)準(zhǔn)

式中，s為發(fā)病等級(jí)，n為相應(yīng)發(fā)病等級(jí)植株數(shù)目，為調(diào)查總株數(shù)觀(guān)測(cè)量。

0＜DI≤20 時(shí)為高抗材料；20＜DI≤40 時(shí)為抗病材料；40＜DI＜60 時(shí)為中間型材料；60≤DI＜80 是為感病材料；DI≥80 為高感材料。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜白粉病病原菌形態(tài)特征

由圖1 可知，取分離純化后南瓜白粉病病原菌在10×40 倍的電子顯微鏡下觀(guān)察分生孢子和纖維狀體，顯示分生孢子呈橢圓形。病原菌分生孢子內(nèi)均含明顯纖維狀體。通過(guò)形態(tài)特征觀(guān)察初步判斷，此白粉病菌為單囊殼白粉菌（）。

圖1 南瓜白粉病病原菌形態(tài)觀(guān)察

2.2 南瓜白粉病病原菌分子鑒定

利用真菌DNA 提取試劑盒（天漠生物）提取白粉病病原菌的DNA，利用通用引物ITS 1、ITS 4 擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為522 bp DNA 片段（圖2）。運(yùn)用DNAMAN 6.0（LynnonBiosoft）將序列與已報(bào)道侵染瓜類(lèi)白粉病病原菌其他序列對(duì)比（圖3），結(jié)果表明，長(zhǎng)沙地區(qū)的白粉病病原菌與序列一致性高達(dá)99%；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），結(jié)果表明南瓜白粉病病原菌ITS 序列相較于.、.、.而言，與單囊殼白粉病（）同源關(guān)系更近。通過(guò)分子鑒定的方法，更進(jìn)一步驗(yàn)證了湖南省長(zhǎng)沙市湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)金山基地南瓜白粉病病原菌種類(lèi)為單囊殼白粉菌（）。

圖2 南瓜白粉病病原菌DNA 擴(kuò)增結(jié)果

圖3 南瓜白粉病病原菌ITS 同源序列對(duì)比

圖4 根據(jù)ITS 序列構(gòu)建南瓜白粉病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 南瓜白粉病病原菌生理小種鑒定

甜瓜鑒別寄主Iran H、Top mark、Védrantais、PMR 45、Nantais Oblong 接種10 d 葉片出現(xiàn)明顯白粉病斑；20 d 后植株葉片及莖干出現(xiàn)濃厚白粉層。而寄主PMR 5、WMR 29、Edisto 47、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR 6 無(wú)白粉病侵染情況，寄主PI 414723 出現(xiàn)極少數(shù)褐色壞死病斑，表現(xiàn)出較強(qiáng)抗病特征。對(duì)比表3 抗感反應(yīng)，確認(rèn)湖南省長(zhǎng)沙市湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)金山基地白粉病病原菌生理小種為單囊殼白粉病菌中的2France。

表3 鑒別寄主對(duì)南瓜白粉病菌抗感反應(yīng)

2.4 南瓜抗白粉病種質(zhì)資源的篩選

由表4 可以看出，從90 份種質(zhì)資源中篩選出9份高抗種質(zhì)、11 份抗病種質(zhì)、30 份中間型種質(zhì)、20份感病種質(zhì)以及20 份高感材料。其中，9 份高抗種質(zhì)全為中國(guó)南瓜類(lèi)型；11 份抗病種質(zhì)包含3 份中國(guó)南瓜類(lèi)型以及8 份印度南瓜類(lèi)型；30 份中間型種質(zhì)包含8 份中國(guó)南瓜類(lèi)型以及22 份印度南瓜類(lèi)型；20 份感病病種質(zhì)包含9 份中國(guó)南瓜類(lèi)型以及11 份印度南瓜類(lèi)型；20 份高感種質(zhì)包含7 份中國(guó)南瓜類(lèi)型以及13 份印度南瓜類(lèi)型。

表4 90 份不同品系南瓜抗病性鑒定

3 討論與結(jié)論

瓜類(lèi)作物白粉病病原菌在無(wú)性形態(tài)上不易區(qū)分，可通過(guò)分生孢子是否具有纖維狀體區(qū)分.和.，臧全宇通過(guò)有無(wú)纖維狀體的方法鑒定出杭州甜瓜白粉病菌屬于.。rDNA 序列克隆分析手段已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原菌的分類(lèi)，其中的ITS 序列進(jìn)化速度快，具有保守性，在不同的科、屬、種的水平上具有特異性，因此，通過(guò)設(shè)計(jì)引物比對(duì)分析病原菌ITS 序列可有效鑒定病原菌。張怡等采集河南周口地區(qū)的白粉病病原菌分析其ITS 序列，鑒定出該地區(qū)的瓜類(lèi)白粉病菌屬于單囊殼白粉菌（.）。本試驗(yàn)中電子顯微鏡下的南瓜白粉病病原菌的分生孢子為橢圓形，3%的KOH 溶液著色效果下，孢子內(nèi)含有纖維狀體，初步判斷其屬于單囊殼白粉菌（.）。通過(guò)ITS 序列比對(duì)分析可知，長(zhǎng)沙地區(qū)南瓜白粉病病原菌（圖3 中HNCSJSJDLH）與、、、、及的ITS 序列高度同源，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析可知，本試驗(yàn)中白粉病病原菌（圖4 中HNCSJSJDLH）與聚類(lèi)在同一分支，進(jìn)一步確定長(zhǎng)沙地區(qū)南瓜白粉病病原菌屬于單囊殼白粉菌（.）。采用國(guó)際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主明確鑒定出2019 年湖南省長(zhǎng)沙地區(qū)金山基地大棚南瓜白粉病菌的生理小種為2France。

目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道的南瓜抗白粉病種質(zhì)資源鑒定研究主要以美洲南瓜類(lèi)型為主。張旭業(yè)從28 份美洲南瓜材料中篩選出10 份抗病材料。屈淑平等從64 份美洲南瓜材料中篩選出13 份高抗資源和15 份高感材料。筆者對(duì)收集的90 份南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行白粉病抗性鑒定，得到9 份高抗種質(zhì)、11份抗病種質(zhì)、30 份中間型種質(zhì)、20 份感病種質(zhì)以及20 份高感材料。其中，高抗種質(zhì)均為中國(guó)南瓜類(lèi)型，感病材料多為印度南瓜類(lèi)型，初步推斷，可能中國(guó)南瓜在白粉病抗性方面優(yōu)于印度南瓜，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。本試驗(yàn)為抗白粉病種質(zhì)資源的挖掘、抗病基因定位研究以及抗病新品種的創(chuàng)制奠定了一定基礎(chǔ)。