寧夏中南部地區牛支原體病原學檢測及分離鑒定

馬 林，周海寧，楊佳冰，馬 龍，閔 澤，魏凡華，李知新

（1.寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021；2.寧夏回族自治區動物疾病預防控制中心，寧夏銀川 750011）

牛支原體（Mycoplasma bovis）可引起牛的肺炎、關節炎、乳房炎、生殖道炎癥以及流產、不孕等癥狀[1]。自1961 年美國從患有乳房炎的病牛中成功分離出支原體病原后[2]，牛支原體感染病例在很多國家被發現并報道。我國在1983 年首次從患有乳房炎奶牛產的牛乳中分離出支原體[3]，2008年在湖北省發現牛支原體感染病例，且成功分離出牛支原體菌株，此后在多地發現牛支原體感染病例[4-5]。2021 年6 月，寧夏中南部西吉、彭陽、隆德、同心等多地發現以發熱、咳嗽、流鼻涕、肺部壞死為典型癥狀的病牛，對當地肉牛的健康造成了很大的威脅[6-7]，初步懷疑此區域存在牛支原體感染。為進一步了解寧夏中南部地區牛支原體感染情況及流行菌株耐藥性，本試驗采集寧夏中南部9 個縣區牛鼻拭子樣品開展牛支原體調查，以期為寧夏中南部地區牛支原體病防控和臨床用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 2021 年6—10 月，選取寧夏中南部地區曾報道過牛支原體病臨床癥狀的9 個縣區（西吉縣、隆德縣、彭陽縣、涇源縣、原州區、沙坡頭區、海原縣、中寧縣、同心縣）27 個肉牛規模養殖場、9 個肉牛屠宰場、9 個牛羊交易市場，隨機采集牛鼻拭子樣本共495 份，低溫運送至實驗室，4 ℃保存待檢。

1.1.2 主要試劑 PPLO 肉湯，購自青島海博生物有限公司；葡萄糖，購自天津科密歐化學試劑公司；馬血清，購自德寧生物公司；青霉素，購自江西科達公司；瓊脂、酵母粉，均購自美國BD 公司；苯酚紅、丙酮酸鈉，購自北京索萊寶公司；MEM（10×），購自美國賽默飛公司；細菌專用核酸提取試劑盒，購自北京天根生化公司；DL 2 000 DNA Marker，購自北京全式金生物有限公司；藥敏片，購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺，南通嘉程JC-2-1；核酸提取儀，西安天隆科技NP968S；高速離心機，德國艾本德5427R；二氧化碳培養箱，上海力申HF90；振蕩培養箱，金壇億通BS-IE；生物顯微鏡，德國麥克奧迪SK2002ZP；電泳儀，北京六一DYYCP-31C；紫外凝膠成像儀，美國伯樂VnirerallHood Ⅱ。

1.2 方法

1.2.1 培養基配制 PPLO 液體培養基400 mL：葡萄糖2.0 g、PPLO 粉 8.4 g、酵母粉2.0 g，加三蒸水定容至360 mL，充分攪拌使各組分溶解，然后121 ℃ 20 min 高壓滅菌；降溫至50～70 ℃時取出，加入馬血清40 mL、10%精氨酸4 mL、10×MEM 4 mL、8 萬單位青霉素（過濾）4 mL、1%酚紅溶液400 μL。PPLO 固體培養基：葡萄糖0.5 g、PPLO 肉粉10.5 g、瓊脂粉5.0 g、25%酵母浸液2.5 mL，0.4%酚紅溶液2.5 mL，加三蒸水定容至400 mL，用1 mol/L NaOH 調節pH 至7.6～7.8，121 ℃ 20 min 高壓滅菌處理，50～70 ℃時取出，加入馬血清100 mL，丙酮酸鈉 0.5 g，8 萬單位青霉素（過濾）5 mL。

1.2.2 引物合成 參照文獻[8] 設計合成1對支原體16S rRNA 通用引物和1 對牛支原體oppF基因特異性引物用于牛支原體擴增。P1 上：5'-AACTGCTGTGGTTAGGGAAG-3'；P1 下：5'-ACTGAGAACGGTTTTTTGAG-3'。預計擴增目的片段為858 bp。P2 上：5'-TAACATTAGTGTTGTCGCTA-3'；P2 下：5'-TTAATCTTTTTAAACTTGAG-3'。預計擴增目的片段為1 914 bp。引物由安徽通用生物技術有限公司合成。

1.2.3 PCR 檢測 使用細菌專用核酸提取試劑盒提取的樣本DNA 作為模板用于PCR 擴增，所用引物為支原體16S rRNA 通用引物P1（目標片段858 bp）和牛支原體oppF基因特異性引物P2（目標片段1 914 bp）。采用25.0 μL 擴增體系（表1），同時設立陽性、陰性對照組 。P1 反應條件：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃ 10 min；P2 反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃ 10 min。PCR 產物于1%的瓊脂糖凝膠進行電泳后，使用紫外凝膠成像儀分析。

表1 PCR 擴增體系 單位：μL

1.2.4 支原體分離培養與鑒定 無菌條件下，將PCR 鑒定為陽性的鼻拭子樣本，接種于液體培養基，置于37.5 ℃振蕩培養箱培養3～7 d，觀察液體顏色從紅色變為澄亮透明的黃色，吸取1.5 mL 菌液，提取DNA 后再次進行PCR 檢測；將PCR 檢測結果呈陽性的菌液接種于牛支原體固體培養基，置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養3～7 d 后觀察是否有“煎蛋樣”菌落形態，挑取疑似菌體于固體培養基反復傳代3～5 次，直至培養出牛支原體純菌株。

1.2.5 支原體藥敏試驗 參考文獻[9]的操作方法，選取卡那霉素、苯唑西林、鏈霉素、恩諾沙星、環丙沙星、多黏菌素B、泰樂菌素、泰妙菌素、哌拉西林、林可霉素、慶大霉素、土霉素、四環素、頭孢唑林、阿莫西林、氨芐西林等16 種藥敏片進行支原體耐藥性檢測。敏感性、耐藥性的判定標準參考文獻[10]。

2 結果與分析

2.1 感染情況調查

用支原體16S rRNA 通用引物P1 對所有樣本進行PCR 檢測，結果在495 份樣本中檢出陽性59份，總體陽性率為11.92%，9 個縣區的牛支原體陽性率為1.82%～21.82%（表2），其中同心縣陽性率最高，為21.82%；其次為涇源縣，陽性率為20.00%；隆德縣陽性率最低，為1.82%。場點陽性率最高的是屠宰場，陽性率為13.33%，最低的是規模場，為11.11%，3 種場點之間的陽性率差異不顯著（表3）。

表2 各縣（區）不同場點鼻拭子樣本PCR 檢測結果

表3 不同場點鼻拭子樣本牛支原體PCR 檢測結果

2.2 牛支原體分離培養

將檢測結果為牛支原體陽性的鼻拭子，使用液體培養基培養3～7 d，傳3 代后，液體培養基由紅變黃（圖1-A），固體培養基上出現肉眼可見的“針尖樣”大小的無色透明菌落（圖1-B），用40×顯微鏡觀察固體培養基有“油煎蛋樣”菌落形成（圖1-C），吉姆薩染色后成不規則狀（圖1-D）。59份PCR 檢測陽性樣本中，共分離出16 株疑似牛支原體菌株。

2.3 牛支原體菌株PCR 鑒定

使用支原體16S rRNA 通用引物，將16 份疑似牛支原體分離培養物進行PCR 擴增。結果（圖2～3）顯示：4 個分離株的擴增產物均出現預期擴增片段858 bp，進一步使用牛支原體oppF基因特異性引物擴增，4 個分離株均得到約1 914 bp 的目標片段。將支原體16S rRNA 通用引物擴增的核酸產物進行測序比對，結果發現4 個分離株序列與國際標準株PG45（GenBank 登錄號CP002188.1）的同源性均在99%以上，與重慶菌株CQ-70W（GenBank 登錄號CP005933.1）、新疆菌株XJ-1（GenBank 登錄號MW295534.1）、湖北菌株HB0801（GenBank 登錄號 CP007589.1）、寧夏菌株Ningxia-1（GenBank 登錄號CP023663.1）的同源性皆在97%以上，說明分離培養的4 株菌株（NZ-1、NZ-2、NZ-3、NZ-4）均為牛支原體。對所分離的4 株牛支原體16S rRNA 序列與支原體代表菌株通過MAGAX64 軟件進行序列比對分析，用N-J 法建立系統發育樹，結果發現分離的4 株牛支原體菌株均與寧夏菌株Ningxia-1、國際標準菌株PG45 親緣關系最近（圖4），與支原體16S rRNA 通用引物P1、牛支原體特異性引物P2 擴增結果一致。

2.4 藥敏試驗

結果（表3）顯示：從牛鼻拭子中分離的牛支原體對卡那霉素、恩諾沙星、泰妙菌素、林可霉素、慶大霉素、土霉素高度敏感，而對泰樂菌素、四環素中度敏感，對苯唑西林、鏈霉素、環丙沙星、多黏菌素B、阿莫西林、哌拉西林、頭孢唑林、氨芐西林不敏感。

表4 藥敏試驗結果 單位：mm

3 討論

牛支原體病傳播速度快，且無針對性藥物、疫苗進行治療和預防，嚴重威脅我國的肉牛養殖業健康發展。據國外相關報道[11]，英國曾對牛支原體進行血清學檢測，結果發現牛支原體場群抗體陽性率為50%。2019 年趙金玉[12]等采用PCR 檢測方法，對新疆地區牛支原體進行檢測，發現總體陽性率為22.6%。2019 年徐引弟等[13]對河南省屠宰場350 份肺臟組織采用PCR 方法進行牛支原體檢測，結果發現屠宰場陽性率為4.68%。2009 年王曉亮等[14]對寧夏從牛支原體病疫區引進牛、疫區原有牛，分別采集298 份、197 份牛血清進行檢測，結果發現疫區引進牛抗體陽性率為84.6%，疫區原有牛抗體陽性率為38.6%。2016 年郭亞男等[15]對寧夏22個縣區660份牛血清進行牛支原體檢測，發現牛支原體抗體陽性率為19.24%。可見，牛支原體在國內外普遍流行。在已有的國內報道[12-16]中，采用PCR 診斷方法進行分子流行病學調查檢出的支原體陽性率為4.68%～34.22%。本試驗發現，寧夏中南部9 個地區的牛支原體總體陽性率為11.92%，其中規模場、屠宰場、交易市場陽性率分別為11.11%、13.33%、12.59%，與國內地區關于牛支原體感染情況調查的結果基本一致，說明牛支原體在寧夏中南部地區流行率也較高，且規模場、屠宰場、交易市場等場點均有不同程度感染。國內對牛支原體感染情況的調查多為血清學抗體檢測，而本試驗采用分子生物學診斷方法進行牛支原體感染情況調查，針對性較強，調查成本低。本試驗成功從牛鼻拭子樣品中分離獲得4 株牛支原體，與相關報道[17]結果相符，再次驗證了牛鼻拭子可以成功分離培養出牛支原體。

試驗使用牛支原體oppF基因特異性引物，對4株分離株進行PCR 鑒定，均擴增出大小為1 914 bp的目的片段。經16S rRNA 基因序列同源性分析及遺傳進化分析發現，分離株與國際標準株PG45 同源性超過99.0%，與國內重慶株、湖北株、新疆株、寧夏株同源性均高于97.0%，與國際標準株PG45、寧夏菌株Ningxia-1 親緣關系最近。此方法的利用以及鑒定結果與2013 年郭澎強[18]等關于寧夏銀川地區牛支原體疾病診斷、2017 年楊銘偉等[19]對新疆南疆地區犢牛肺炎支原體的分離鑒定具有相似性，說明寧夏中南部地區流行的牛支原體未發生較大的基因變異。

當前，牛支原體病的治療藥物多為抗生素，但支原體對大多數抗生素具有耐藥性，治療效果不明顯[8]。本研究對分離的牛支原體菌株進行藥敏試驗，結果發現分離株對卡那霉素、恩諾沙星、泰妙菌素、林可霉素、慶大霉素、土霉素高度敏感。因此，可結合實驗室藥敏試驗結果進行針對性用藥，而本試驗結果可對寧夏中南部地區牛支原體病的臨床用藥提供參考。

綜上建議，結合寧夏中南部地區牛支原體實際感染情況，繼續進行牛支原體病原學監測及臨床科學合理用藥，加強引進牛群檢疫及屠宰場管控，定期抽樣調查，形成常態化監測，控制本病的流行和蔓延。