豬非典型瘟病毒（APPV）研究進展

張 恒，左媛媛，戈勝強，張 會，宋桂才，吳曉東

（1.山東信得科技股份有限公司，山東青島 266104；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；3.青島韋立國際集團，山東青島 266000；4.山東諸子生物科技有限公司，山東濰坊 262204）

2015 年美國科研人員Hause 等[1]在對1 份豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）實時定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）陽性樣品進行宏基因組測序中，拼接出1 個長度為11 276 bp 的基因組序列；該基因組序列可編碼1 個預測長度為3 635 個氨基酸的多聚蛋白（polyprotein）；該基因組序列同完成部分鑒定的蝙蝠瘟病毒（Rhinolophus affinis pestvirus，RaPV）基因序列的一致性為68%，同已知的瘟病毒屬其他病毒基因序列的一致性為25%～28%；研究認為這是一種新的病毒，應歸于瘟病毒屬，暫時將其命名為豬非典型瘟病毒（atypical porcine pestivirus，APPV）。隨后，Arruda 等[2]在患有先天性震顫（congenital tremor，CT）的病豬中發現APPV，且將感染APPV 豬的帶毒血清接種懷孕母豬后，在所產的仔豬中復制出CT 臨床癥狀。相似的結果也在其他研究[3-5]中得到驗證，如在荷蘭10 個豬場采集的具有CT 癥狀的99 份疑似樣品中，APPV 檢出率達到100%，而在采自無臨床癥狀的豬樣品中，APPV 檢出率只有9%（6/66），說明APPV 與CT 密切相關。

仔豬CT 也被稱為“豬先天性痙攣癥”或“仔豬先天性肌陣攣病”（myoclonia congenita）[6]、“仔豬震顫病”（shaking piglets/ trembles）、“跳跳病”（jumpy pig disease）、“舞蹈病”（dancing pig disease）[7]等，在國內形象地將其稱為“仔豬抖抖病”。它最早于1922 年在美國以“舞蹈病”相稱[7]。隨后在法國（1934 年）[8]、澳大利亞（1937年）[9]、加拿大（1957 年）[10]相繼有此病的報道。我國最早可能于1962 年報道此病，稱其為“仔豬先天性肌陣攣病”[6]?，F在歐洲以及北美洲、南美洲等地區皆有病例報道，說明該病已呈全球流行趨勢[2]。

國內有人將APPV 命名為非典型豬瘟病毒。鑒于國內存在非典型性豬瘟的持續流行，為避免誤解，本文將該病毒翻譯為豬非典型瘟病毒，以示區別。自2015 年APPV 在美國首次被發現以來，國外相關的文獻報道越來越多。國內也有相關研究跟進，但還沒有關于APPV 研究進展的報道。因此，本文就APPV 的病原學、流行病學、檢測技術研究以及疫苗研發等進行全面介紹，以期為我國APPV防控及研究提供參考。

1 病原學

APPV 屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），為單股正鏈RNA 病毒。根據最新的進化趨勢，國際病毒分類委員會于2017 年發布的分類指南中，將瘟病毒屬劃分為11 個分支（A—K），而APPV 為瘟病毒屬K（PestivirusK）的代表毒株[11]。

APPV 基因組全長11～12 kb（11 475 bp[12]、11 526 bp[13]），包括5'-UTR 和3'-UTR 非編碼區及1 個多聚蛋白閱讀框。該閱讀框主要編碼1 個長的多聚蛋白前體（大小約3 635 個氨基酸）。該多聚蛋白可被蛋白酶水解成多個結構蛋白和非結構蛋白。與其他瘟病毒屬病毒一樣，該多聚蛋白包含所有的結構蛋白（C、Erns、E1、E2）及非結構蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B），其編碼順序為Npro-C-Erns-E1-E2-P7-NS2-3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B[1]。目前還未涉及APPV 的功能基因組學研究，但利用E2 和Npro蛋白編碼全基因的序列比對，可將APPV 分為4 個基因型（A—D）[12]。有研究[14]還發現，與同為瘟病毒屬的古典豬瘟病毒（CSFV）相比，APPV 不同毒株之間的遺傳變異性較大（最大遺傳距離差異可達21%），且有1 株中國分離株在非結構蛋白NS5A 區域內發生了93 個核苷酸的缺失。

2 流行病學

2.1 宿主

家豬和野豬均可攜帶APPV。瘟病毒屬病毒可以在種間傳播，因此不排除豬以外其他動物有感染APPV 的可能性，但在自然傳播中僅限于偶蹄動物之間。根據目前研究顯示，未從羊樣品中檢出該病毒[15]。

2.2 病毒侵襲性

利用RT-qPCR 方法可從感染仔豬的多種組織樣品中檢出APPV，檢出率從高到低依次為全血95%、腸系膜淋巴結90%、支氣管淋巴結90%、胸腺90%、脾臟90%、腦干90%、小腦88%、腎臟85%、心臟85%、脊髓80%、大腦73%、血清63%、糞便34%和鼻拭子29%。血清、鼻拭子、腦脊髓液、腸系膜淋巴結、支氣管淋巴結、脾臟和臍帶血中的病毒含量較高，糞便、小腦、脊髓、腎臟、胸腺和心臟中的病毒含量次之，大腦、腦干和全血中的病毒含量最低[2]。另據報道[4]，各部位中的APPV 含量由高到低依次為腭舌弓腺、頜下淋巴結、胃、鼻腺、小腦、三叉神經、肱二頭肌、肱神經叢、結腸、小腸、坐骨神經、胸腺、支氣管肺淋巴結、腎臟、脊髓腰神經、腎臟、肺臟、最長肌、胸部脊髓和腦干。

我國科研人員也進行了APPV 侵襲性研究。Yuan 等[16]研究發現，APPV 對神經系統及外周免疫器官具有偏嗜性；Shen 等[17]發現，各臟器中的病毒含量以小腦和心臟最高，其他依次為脊髓、肺臟、脾臟、腎臟、頜下淋巴結、腹股溝淋巴結、肺門淋巴結、大腦和肝臟。

Schwarz 等[5]研究發現，APPV 核酸可在仔豬血清和唾液中持續存在12 周以上。Ed Groof[3]研究發現，APPV 陽性仔豬到第5 個月時，病毒血癥滴度才開始下降。以上結果均很好地解釋了為何APPV 感染農場會持續出現新的病例。

2.3 傳播途徑

對APPV 的自然傳播途徑目前還不清楚。但有研究[4]發現，APPV 在唾液腺、十二指腸、胰腺和結腸中的滴度較高，因此推測APPV 也可能通過糞-口途徑傳播；攻毒試驗結果顯示，APPV 可經母豬垂直傳播給仔豬，導致仔豬發病，且與CSFV和牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）相比，可能更容易垂直傳播。

Gatto 等[18]對美國4 個種豬場進行APPV 檢測，發現APPV 在包皮拭子、包皮液和精液中的檢出率分別是23.81%（5/21）、22.81%（26/114）和12.91%（59/457）。但APPV 是否能通過精液傳播還需進一步研究。

另有報道[19]猜測，氣溶膠可能對APPV 傳播發揮一定作用。

2.4 有關國家流行病學調查

在美國首次報道APPV 后，西班牙[3]、奧地利[5]、意大利[20]、德國[16，21]、瑞典[21]、英國[22]、荷蘭[3]等歐洲國家，加拿大[23]、巴西[24]等美洲國家，以及中國[13-14，17-18，25]、韓國[26]等亞洲國家均報道發現該病毒。在對歐洲和亞洲的1 460 份血清樣品的普查中，發現APPV核酸陽性率為8.9%（130份），血清陽性率約為60%[14]。德國的調查[4，27]顯示，APPV 在健康豬群中的個體流行率約為2.4%，場間流行率約為10%，野豬感染率達19%。

APPV 被發現后，國內科研人員很快進行了相關調查。Zhang 等[26]在廣東省2 個豬場中發現有APPV 流行（發病率分別為5.8%和6.3%），并對測序毒株（GD1 株和GD2 株）進行了比對分析。Zhang 等[12]和Wu 等[13]分別對APPV 廣西株（CH-GX 2016）和江西株（JX-JM01-2018A01）進行了全基因組測序分析。Shen 等[17]在2016 年監測發現，廣東省一豬場（存欄3 000 頭，發病率為2.67%，死亡率為60%）和貴州省一豬場（存欄800 頭，發病率約為50%）均發生“仔豬抖抖病”，經RT-PCR 檢測，均檢出APPV 核酸陽性，并將測序毒株命名為APPV-China/GZ01/2016（GZ01）和APPV-China/GD-SD/2016（GD-SD）。Yuan 等[16]對我國南方地區（主要是廣東?。┻M行監測發現，APPV 的場內流行率為0～20%，個體平均流行率約為5.2%。

其他國家的研究人員對其保存的歷史樣品進行了追溯性研究，如2016 年荷蘭的De Groof 等[3]（2012 年樣品）、2016 年德國的Postel 等[4]（2007年樣品）和2017 年西班牙的Mu?oz-González等[28]（1997 年樣品）均從實驗室歷史保存樣品中檢測到APPV 陽性。Yuan 等[16]對已公布的APPV序列進行起源和遺傳進化分析，結果發現APPV 中國分離株極有可能起源于德國。綜上說明，APPV早已在全球廣泛流行。

3 檢測與診斷技術

CT 至今已出現100 年，可由多種病原導致，除APPV 外還包括CSFV、豬圓環病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）、豬捷申病毒（porcine teschovirus，PTV）、豬腸道病毒（porcineenteroviruses，PEV）、豬薩佩羅病毒（porcine sapelovirus，PSV）。臨床中的混合感染現象也較嚴重，如Ed Groof 等[3]發現攻毒試驗中所使用的APPV 陽性血清污染有星狀病毒（astrovirus），Possatti 等[29]發現PTV 和APPV 混合感染后可能導致仔豬死亡率增高等。因此，APPV 的實驗室檢測至關重要。

3.1 病原分離與鑒定

Hause 等[1]初次分離APPV 時，曾用MARC-145、Vero、Vero 76、HCT-8、BT、MDBK、ST、PK-15 和MDCK 細胞系進行分離，但在培養過程中均未觀察到細胞病變，且傳代2 次后RT-qPCR檢測全部為陰性，病毒分離失敗。Ed Groof 等[3]使用PK-15、SK6 和原代豬腎細胞（primary swine kidney cells），Postel 等[4]使用瘟病毒屬敏感細胞系（PK-15、SK6和STE）、豬淋巴細胞38A1D（porcine lymphoma cells）和豬上皮細胞PEDSV.15（porcine endothelial cells），Yuan 等[16]使用PK-15、SK6、IBRS 和豬睪丸細胞（swine testis cellline，ST）進行病毒分離，結果均以失敗告終。Arruda 等[2]也曾嘗試分離病毒進行攻毒試驗，結果也未成功。而Schwarz 等[5]使用了未吃母乳的APPV 陽性仔豬血清，可以在SK6 細胞和PK-15 細胞中將APPV 傳代到第5 代，只是病毒滴度很低，提示初乳中的抗體可能在病毒分離過程中發揮了一定的阻礙作用。目前只有德國科學家Beer 等[15]利用豬腎細胞（SPEV）成功分離到APPV，Postel 等[20]利用該細胞系將APPV 傳代至少11 代。由此可見，APPV在細胞系中的繁殖感染水平較低，這可能與其E2蛋白的特殊結構有關[3]。

3.2 分子生物學鑒定

RT-qPCR 和逆轉錄PCR（RT-PCR）是檢測APPV 的主要方法。目前建立的RT-qPCR/RT-PCR方法主要對NS3[2]、NS5A[17]、NS5B[5]、5'非翻譯區（5'non-translated region，NTR）[3]等區域進行擴增。但因為可參考的APPV 基因序列較少，很多引物仍需要進行深入論證，如Postel 等[20]發現，針對瘟病毒屬的NTR 引物（PanPesti140f 和PanPesti241r）可以與APPV和CSFV發生交叉反應。

其他方法也可用于APPV 檢測，如針對NS3和NS4B 的SYBR Green 方法[4]和套式PCR（RTnested PCR）方法。Possatti 等[29]使用針對NS5B基因的套式PCR 和針對NS2/3 區域的半套式PCR（semi-nested PCR）進行檢測，結果發現針對NS2/3 區域的擴增效果好于NS5B基因，其原因可能是因為設計NS2/3 區域引物時可供參考的APPV序列更多。

3.3 血清學鑒定

目前尚無商品化的血清學診斷試劑盒面世，但相關研究已迅速啟動。Hause 等[1]和Postel 等[20]分別建立了針對APPV Erns蛋白的間接ELISA方法，其中Postel 等將其建立的ELISA 方法與商品化的CSFV 試劑盒（針對E2 蛋白，IDEXX 和Idvet 廠家）和瘟病毒屬特異ELISA 試劑盒（針對NS3 蛋白，IDEXX 廠家）進行了比較，證實目前所用的CSFV 試劑盒和瘟病毒屬特異ELISA 試劑盒不能與APPV 陽性血清發生交叉反應。另外Schwarz等[5]建立了針對APPV NS3 蛋白的阻斷ELISA 方法，并將其用于血清學臨床監測。

4 疫苗研發和治療

4.1 疫苗研發

目前尚無APPV 疫苗研發的報道，但據了解，國內一些研究機構和大型動物疫苗生產企業已經著手此疫苗的研發（包括弱毒苗和E2 亞單位疫苗，目前尚無產品申報注冊）。動物攻毒效力檢驗是評價動物疫苗好壞的主要標準，但是到目前為止，APPV 的病毒分離和豬攻毒模型試驗仍很難建立。其原因：弱毒疫苗致弱過程需要能夠繁殖APPV 的細胞系，且病毒滴度相對較高才能應用于生產；而攻毒模型建立存在的主要問題是APPV 是否需要與其他病毒（CSFV、偽狂犬病毒等）協同作用才能引起震顫等癥狀尚未確定。這些給疫苗研發和生產帶來很大阻力。

4.2 治療

目前針對APPV 感染無特效藥物治療。導致仔豬死亡的主要原因是病毒感染導致的震顫使仔豬不能及時吃上初乳或母乳饑餓而死，因此可采取代養或人工哺乳方式，提高仔豬的自然恢復能力，而護理程度直接關系到感染豬群的死亡率。

5 結語

綜上所述，APPV 作為新發現的病原，基礎研究相對較少，目前僅證實其與CT 緊密相關。雖然對懷孕母豬接種帶毒血清可以導致仔豬發病，但是因為APPV 不容易被分離，缺少最重要的病毒攻毒試驗結果，其致病機理仍需要進一步研究證實。而疫苗研究也需要在前期基礎研究深入的基礎上才有可能獲得成功。同時，APPV 和其他多種病原均可引起CT，且臨床中混合感染現象嚴重，因此其感染需要全面考慮臨床癥狀，才能給予正確的判斷和處置。深入了解APPV 的病原學、流行病學，特別是其引發的感染免疫學、致病機理和發病進程，對于APPV 感染的有效診斷、預防和治療具有重要意義。