流浪犬狂犬病口服疫苗免疫效果評估

白藝蘭，楊顯超，劉 健，夏爐明，陳偉鋒，龔國華，朱曉英，陶田谷晟，常曉靜，桂亞萍，李增強，王 建，趙洪進

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

狂犬病（rabies）俗稱“瘋狗病”，是一種主要在犬科動物中傳播和流行的人獸共患傳染病。患病動物或者人一旦發病，死亡率幾乎為100%[1]。在狂犬病預防和控制中，疫苗免疫是主要措施[2]。目前，我國廣泛使用的狂犬病滅活疫苗均為注射劑，對流浪犬及野生動物適用性不強，而狂犬病口服疫苗已在部分發達國家野生動物狂犬病防控中起到重要作用。因此對流浪犬采用狂犬病口服疫苗免疫，提高免疫合格率，是控制狂犬病在流浪犬中流行的可行措施之一[3]。

以犬2 型腺病毒（canine adenovirus type 2，CAV-2）為載體表達狂犬病病毒糖蛋白（RABV-G）的重組活疫苗，因其自身優點得到越來越多的研究應用[4]。CAV-2 能夠高效轉導外源基因，刺激呼吸道及消化道，誘發黏膜免疫，增強機體免疫原性[5]。此外，CAV-2 不能在人體內復制，其生產及使用安全系數高[6]。CAV2-ΔE3-CGS 是以CAV-2 缺失E3基因為載體表達狂犬病病毒糖蛋白的重組病毒疫苗，經口服可使犬產生狂犬病病毒糖蛋白抗體，已于2007 年獲得農業部頒發的農業轉基因生物安全證書（生產應用）。為了解CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗在流浪犬體內產生的抗體水平，探索抗體的產生規律，選取上海市收容的流浪犬進行CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗免疫試驗，測定狂犬病病毒ELISA 抗體，以期為流浪犬狂犬病免疫提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源 上海市公安局犬類留驗所收容的流浪犬。

1.1.2 疫苗和主要試劑 狂犬病口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 及誘餌原料（肉骨粉、面粉、犬糧、魚粉），由軍事科學院軍事醫學研究院軍事獸醫研究所扈榮良老師惠贈；傳統狂犬病疫苗，購自默沙東動物保健品（上海）有限公司；食品級腸衣，購自當地農貿市場；MDCK 細胞，由上海市動物疫病預防控制中心獸醫實驗室保存；犬腺病毒（CAV）IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒（批號D031521），購自荷蘭EVL 公司；狂犬病病毒抗體ELISA 檢測試劑盒（批號19ZEAW010），購自美國SYNBIOTICS 公司；犬瘟熱病毒RT-PCR 檢測試劑盒（EC20200601）、犬細小病毒PCR 檢測試劑盒（批號EC20200602-01），均購自上海爾創生物技術有限公司。

1.2 口服疫苗病毒株病毒滴度TCID50 測定

取生長狀態良好的MDCK 細胞，以胰酶消化后用DMEM 培養基重新懸浮，接種至96 孔板，每孔100 μL（2×106個細胞/mL）；待細胞長成單層后，棄去上清，每孔加入100 μL 10 倍倍比稀釋的CAV2-ΔE3-CGS 病毒液，共11 個稀釋度，每個稀釋度重復8 個孔，最后一列為空白對照，混勻后置于37 ℃感作1 h；棄去培養液，加入2% DMEM培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h；通過顯微鏡觀察細胞病變情況，按Reed-Muench 法計算病毒TCID50，將病毒液按照每頭份1×108個TCID50的規格進行分裝，凍干，置于-20 ℃保存備用。

1.3 口服疫苗誘餌制備

準備1 kg 誘餌原料（肉骨粉40%、面粉25%、犬糧30%和魚粉5%），加入200 g 純凈水后充分混勻成面團狀，用骨型模具壓制成骨頭形狀，60 ℃烘干12 h 后成型。誘餌規格為骨型，長10.0 cm，中間寬1.5 cm；中空，空腔長、寬、高分別為5.0、1.0、0.3 cm，中間放入腸衣包裹的狂犬病口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS，并用食用蠟密封。其中狂犬病口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 制作流程：將腸衣制成長、寬、高分別為5.0、1.0、0.3 cm 規格的密封袋，每個里面裝有1×108個TCID50的口服疫苗凍干粉。

1.4 試驗犬只確定及免疫分組

1.4.1 狂犬病病毒抗體ELISA 檢測 從犬類留驗所收容的流浪犬中隨機挑選32 只（編號為1～32），采集血清，應用狂犬病病毒抗體ELISA試劑盒開展檢測，剔除狂犬病抗體陽性犬只。

1.4.2 CAV IgG 抗體ELISA 檢測 對剔除狂犬病抗體陽性犬后的剩余犬只，應用CAV IgG 抗體ELISA 試劑盒開展檢測，剔除CAV 抗體陽性犬只。

1.4.3 犬瘟熱病毒、犬細小病毒病原學檢測 采集流浪犬肛拭子，應用犬瘟熱病毒RT-PCR 檢測試劑盒、犬細小病毒PCR 檢測試劑盒，進行犬瘟熱、犬細小病毒檢測，剔除犬瘟熱、犬細小病毒病原學檢測陽性犬只。

1.4.4 流浪犬分組 對12 只檢測合格的流浪犬進行分組標記，其中CAV2-ΔE3-CGS口服免疫組5只、傳統疫苗注射組5 只、陰性對照組2 只。統計試驗犬只犬種、月齡、性別等基本信息。

1.5 免疫程序

1.5.1 口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 組 CAV2-ΔE3-CGS疫苗對犬只進行兩次口服免疫，首次免疫（首免）2 周后進行加強免疫（二免）。首次免疫后每周采集血清1 次，二免后第3 周停止采血。

1.5.2 傳統疫苗注射組 按照免疫注射要求，將傳統狂犬病注射疫苗對犬只進行1 次注射免疫，免疫后每周采集血清1 次，采集至注射疫苗二免后第3 周。

1.5.3 陰性對照組 陰性對照組犬只口服不含CAV2-ΔE3-CGS 疫苗的誘餌，同樣進行兩次口服。首次口服后每周采集血清1 次，二次口服后第3 周停止采血。

1.6 狂犬病抗體檢測

按照免疫程序采集試驗犬只血清（包括免疫前血清），使用狂犬病病毒抗體ELISA 試劑盒進行抗體檢測，評估疫苗免疫效果。

2 結果

2.1 狂犬病抗體水平ELISA 檢測

采集試驗犬只血清，使用ELISA 試劑盒測定狂犬病病毒血清抗體水平，檢測結果見表1。口服疫苗組犬只抗體產生速度較慢，8、10 和13 號犬只在二免后第3 周抗體水平分別達0.87、1.23、1.68 IU/mL，超過了國標GB/T 34739—2017 中要求的0.50 IU/mL，即產生了完全保護力；7、15 號犬只在兩次免疫后抗體水平最高僅分別為0.20 和0.07 IU/mL，未產生完全保護力。傳統疫苗注射組中，26、27 和28 號犬只在免疫后1周即產生了抗體，其中26、27 號犬只抗體水平均超過0.50 IU/mL，28 號犬只在免疫后第2 周抗體水平超過0.50 IU/mL；21 號犬只抗體產生較慢，在免疫后第5 周抗體水平才達0.52 IU/mL；23 號犬只免疫后抗體水平最高僅為0.22 IU/mL，沒有產生完全保護力。陰性對照組犬只抗體水平均為0，對照成立。

表1 流浪犬狂犬病病毒抗體水平ELISA 檢測結果

2.2 狂犬病病毒抗體水平消長趨勢

口服疫苗組60%犬只狂犬病病毒抗體達到保護水平（抗體合格率60%），其平均抗體水平在二免后呈直線上升趨勢（圖1）。首免后1 周，抗體水平基本為0，但是首免2 周后平均抗體水平達到0.23 IU/mL；二免后抗體水平首先呈下降趨勢，在二免后第3 周抗體水平快速上升，平均抗體水平達0.81 IU/mL。傳統疫苗注射組犬只狂犬病抗體水平合格率為80%，平均抗體水平在免疫后第1 周即能達到0.30 IU/mL，免疫后2 周可達0.68 IU/mL，然后保持在較高水平。

3 討論

人和犬的狂犬病在大多數發達國家和部分發展中國家都已消除，其措施主要是對家養犬進行大面積疫苗免疫并采取嚴格預防措施，對野生動物進行誘餌口服免疫，切斷野生動物狂犬病傳播至犬而再度傳播至人的途徑，最終達到持久性消除狂犬病效果[7]。在口服疫苗對野生動物免疫成功的基礎上，世界衛生組織（WHO）提出并建議采用誘餌口服免疫流浪犬，以提高犬的免疫覆蓋率，從而達到控制和消除狂犬病的目的[8-9]。2009—2019 年，上海市人間狂犬病病例傳染源主要來自流浪犬[10]，雖然沒有直接證據表明流浪貓是狂犬病的直接傳染源，但流浪貓依然是狂犬病的潛在宿主。因此，口服疫苗免疫是城市流浪動物狂犬病免疫的主要手段之一，也是傳統注射免疫的重要補充。

上海市公安局犬類留驗場內收留流浪犬只多為田園犬。本試驗選取健康流浪犬作為試驗動物，飼喂口服疫苗前，應用狂犬病病毒ELISA 試劑盒進行抗體檢測，剔除了抗體水平≥0.50 IU/mL 的抗體陽性犬只，免疫前血清中存在的低量狂犬病病毒抗體不會對試驗結果產生影響。受流浪犬留驗場環境及工作人員數量限制，最終選取12 只流浪犬作為試驗動物開展初步評估，試驗結果對后續口服疫苗優化及免疫程序制定將起到參考作用。

口服疫苗組中，不同品種、性別、月齡的犬只平均抗體水平總體呈波浪狀上升趨勢。首免后抗體水平雖快速上升，但是幅度不大，只有13 號犬只抗體水平達到0.61 IU/mL；二免后抗體水平開始下降，二免第2 周后迅速升高，第3 周后平均抗體水平達到0.81 IU/mL，說明CAV2-ΔE3-CGS 疫苗口服一次不能完成免疫，應進行兩次才能達到較好保護水平。口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 免疫抗體合格率為60%，說明CAV2-ΔE3-CGS 疫苗口服免疫可以使過半數流浪犬產生狂犬病病毒抗體，抗體水平高于國標GB/T 34739—2017 所要求的0.50 IU/mL，可產生完全保護作用，符合狂犬病防控中對于狂犬病疫苗的要求[11]。陳奇等[12]以表達狂犬病病毒SRV9 株糖蛋白的重組桿狀病毒接種小鼠，發現其可誘導產生抗狂犬病病毒中和抗體，達到保護水平的小鼠比例可達100%。韓乃君等[6]研究顯示，口服和注射一次表達狂犬病病毒糖蛋白的CAV-2 活載體重組疫苗，可使中和抗體達到保護水平。此外，留驗場收容犬的免疫狀態、生活環境和飼養條件均可能影響免疫效果。本試驗中，7 號和15 號犬只抗體水平未能達到保護效價，推測可能與誘餌適口性[13]、流浪犬免疫狀態、個體差異、環境條件、營養、溫度等因素有關。加之在進行流浪犬口服免疫時，氣溫較低，飼養環境較差，犬只有不同程度感染和發病，可能也會間接導致口服免疫失敗。傳統疫苗注射組23 號犬只抗體未能達到保護水平以及21 號犬只抗體產生緩慢，也間接反映出部分流浪犬免疫狀態不佳，免疫應答遲緩。

CAV2-ΔE3-CGS 疫苗為CAV-2 載體缺失重組活疫苗，免疫流浪犬后可產生狂犬病病毒G 蛋白抗體和CAV-2 抗體，流浪犬機體中帶有CAV 抗體會嚴重影響免疫效果。因此，在有專人集中管理、有條件進行群體免疫的流浪犬收容場所，建議對流浪犬CAV 本底抗體進行檢測，評估犬群是否可免疫CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗，以提高免疫效果[14]。同時要加強流浪犬群體疫病防控和飼養管理，防止免疫過程中產生應激或繼發其他疫病。CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗雖然能使流浪犬產生保護性抗體，但是免疫犬抗體本底情況、飼養條件、健康狀況、誘餌劑型、免疫程序等都會影響免疫效果，應當進一步研發合理的誘餌劑型，探索腸溶型誘餌制劑，提高腸黏膜免疫[15]，摸索最佳免疫程序，制定合理免疫方案，從而使口服疫苗達到最佳免疫效果。