禽源空腸彎曲桿菌耐藥性與致病性研究

王 娟，黃秀梅，張青青，劉俊輝，王 琳，劉 娜，王君瑋，曲志娜

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

空腸彎曲桿菌是一種人獸共患病病原體，是在全球范圍內(nèi)引起人類腹瀉的主要細(xì)菌性病原菌之一[1]。該菌可定殖在多種動(dòng)物腸道內(nèi)，正常情況下不引起動(dòng)物發(fā)病，但可通過糞便對(duì)周圍環(huán)境和水源造成污染。空腸彎曲桿菌腸炎的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家超過細(xì)菌性痢疾，在發(fā)展中國(guó)家?guī)缀跖c細(xì)菌性痢疾相近，在我國(guó)該菌也是主要腹瀉病原菌之一[2]。家禽是空腸彎曲桿菌群的主要攜帶者，是彎曲桿菌病的主要感染來源，所以加強(qiáng)禽源空腸彎曲桿菌監(jiān)測(cè)是控制空腸彎曲桿菌流行的前提，對(duì)公共衛(wèi)生具有重要意義。為了解空腸彎曲桿菌通過家禽傳播給消費(fèi)者的風(fēng)險(xiǎn)，本研究分析了肉雞養(yǎng)殖和屠宰環(huán)節(jié)空腸彎曲桿菌的毒力基因攜帶、致病性及耐藥情況，以期為我國(guó)動(dòng)物產(chǎn)品安全和公共衛(wèi)生監(jiān)管以及空腸彎曲桿菌病防控研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 空腸彎曲桿菌（ATCC 33560），購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑 空腸彎曲桿菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)（Skirrow）以及配套添加劑，購(gòu)自Sigma 公司；哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司；Bolton 肉湯干粉、綿羊全血，購(gòu)自青島海博生物科技公司；微需氧產(chǎn)氣袋，購(gòu)自日本三菱MGC公司；DNA Marker、TaKaRa LATaq?酶，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；2×PCR Master Mix，購(gòu)自Promega 公司；抗菌藥物藥敏板，購(gòu)自上海星佰生物有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 204 只ICR 小鼠，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱，為美國(guó)NUAIRE 公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自Bio-Rad 公司。

1.2 樣品采集

1.2.1 泄殖腔拭子樣品 采集山東省膠東地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)肉雞泄殖腔拭子300 份。

1.2.2 肉雞胴體表面拭子樣品 采集山東省膠東地區(qū)某肉雞屠宰線胴體表面拭子300 份。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定

1.3.1 細(xì)菌分離與純化 將采集的樣品拭子放入Bolton 肉湯，在微需氧條件下盡快運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h，將增菌液轉(zhuǎn)接種至Skirrow培養(yǎng)基，42 ℃微需氧繼續(xù)培養(yǎng)48 h；觀察菌落形態(tài)，選擇透明、扁平、濕潤(rùn)的菌落，接種于哥倫比亞血平板進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.3.2 初步鑒定 革蘭氏染色、鏡檢以及氧化酶試驗(yàn)和生長(zhǎng)試驗(yàn)，均按照GB/T 4789.9—2016 進(jìn)行。

1.3.3 PCR 鑒定 將純化的彎曲桿菌菌落采用煮沸法提取模板后，應(yīng)用建立的PCR 方法[3]對(duì)其進(jìn)行鑒定。引物（JunF：5'-CATCTTCCCTAGTCAAGCCT-3'；JunR：5'-AAGATATGGCACTAGCAAGAC-3'）由青島睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為773 bp。反應(yīng)體系25.0 μL：2×PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，去離子水9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸4 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 耐藥性檢測(cè)

按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）2019 推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定分離菌株對(duì)8 種抗菌藥物的MIC 值。8 種抗菌藥分別為阿奇霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素、萘啶酸、泰利霉素、克林霉素。

1.5 毒力基因檢測(cè)

毒力基因是空腸彎曲桿菌的主要致病因素。在整個(gè)致病過程中，多種毒力基因參與其中，相互協(xié)調(diào)，發(fā)揮作用。cheY、cheW等基因與趨化有關(guān)，flaA、cadF、peb1A、racR等基因與粘附定殖有關(guān)，ciaB、pldA等基因與侵襲有關(guān)，還可產(chǎn)生細(xì)胞致死性膨脹毒素、細(xì)胞緊張性毒素等外毒素和內(nèi)毒素[4]。依據(jù)參考文獻(xiàn)[5-6]設(shè)計(jì)16 對(duì)與上述致病機(jī)制有關(guān)的基因引物（表1），用PCR 方法對(duì)空腸彎曲桿菌分離株進(jìn)行毒力基因檢測(cè)。

表1 毒力基因PCR 引物序列及擴(kuò)增片段大小

1.6 動(dòng)物試驗(yàn)

將分離菌株接種至哥倫比亞血平板，收集平板上的菌苔置于滅菌生理鹽水中，振蕩混勻，用平板計(jì)數(shù)法調(diào)整菌懸液活菌數(shù)為2×1010CFU/mL；選擇攜帶不同組合毒力基因的代表性菌株50 株（攜帶15 種、11 種毒力基因菌株各4 株，攜帶14 種、13 種、12 種毒力基因菌株各14 株），同時(shí)將204只ICR 小鼠隨機(jī)均分成51 組（50 個(gè)試驗(yàn)組及1 個(gè)陰性對(duì)照組），試驗(yàn)組小鼠每組接種一株菌，接種菌液量為0.2 mL/只，陰性對(duì)照組小鼠注射生理鹽水（0.2 mL/只）；接種后每12 h 觀察1 次，連續(xù)觀察7 d，記錄病理變化；試驗(yàn)期間采集小鼠糞便，進(jìn)行病原菌分離、鑒定；將發(fā)病小鼠解剖后對(duì)肝臟和脾臟進(jìn)行病原菌分離。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離、純化與鑒定

經(jīng)過細(xì)菌分離純化，從采集樣品中共分離到241 株細(xì)菌，其中有162 株來自肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)，79 株來自肉雞屠宰線，分離率為40.17%（241/600）。分離菌在哥倫比亞血平板培養(yǎng)后為灰色、扁平、濕潤(rùn)有光澤的成片菌苔或單個(gè)菌落（圖1）；革蘭氏染色及鏡檢結(jié)果顯示，分離菌為革蘭氏陰性，呈彎曲小逗點(diǎn)狀或S 形、螺旋狀、海鷗展翅狀（圖2）；氧化酶試驗(yàn)為紫紅色、紫羅蘭或深藍(lán)色；生長(zhǎng)試驗(yàn)顯示，無菌生長(zhǎng)的菌落為彎曲桿菌。

對(duì)初步鑒定為彎曲桿菌的分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將大小約為773 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖3）送青島睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。所得序列NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比對(duì)結(jié)果顯示，其與空腸彎曲桿菌匹配度達(dá)99.5%以上，說明擴(kuò)增基因片段為空腸彎曲桿菌16S rRNA 基因的保守區(qū)序列。

2.2 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，241 株分離菌株對(duì)8 種抗菌藥物均有不同程度耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素的耐藥性尤為嚴(yán)重，耐藥率分別為97.75%、96.78%、95.18%。其中養(yǎng)殖環(huán)節(jié)分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星、四環(huán)素的耐藥率高達(dá)100%，對(duì)萘啶酸的耐藥率為98.67%；屠宰環(huán)節(jié)分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素的耐藥率分別為93.33%、93.33%、84.44%。屠宰環(huán)節(jié)分離菌株對(duì)阿奇霉素、紅霉素、泰利霉素、克林霉素等4 種藥物的耐藥率在5.00%以下，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)分離菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物（阿奇霉素、紅霉素、泰利霉素）的耐藥率較屠宰環(huán)節(jié)分離菌株高約35.00%。

2.3 毒力基因檢測(cè)

如表2 和圖5 所示，除未檢測(cè)到VirBII基因，以及neuB基因攜帶率較低外，其他14 種毒力基因攜帶率均較高，有11 種達(dá)到90%以上。針對(duì)所檢測(cè)的16 種毒力基因，241 株空腸彎曲桿菌分離株中有4 株含有15 種毒力基因，占總分離數(shù)的1.66%；75 株含有14 種毒力基因，占總數(shù)的31.12%；85 株含有13 種毒力基因，占總數(shù)的35.27%；71 株含有12 種毒力基因，占總數(shù)的29.46%；4 株含有11 種毒力基因，占總數(shù)的1.66%；只有2 株含有5 種毒力基因。不同毒力基因PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖6。

表2 分離菌株攜帶毒力基因情況

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

選擇攜帶不同組合毒力基因的代表性菌株50株，對(duì)試驗(yàn)組小鼠腹腔注射2×1010CFU/mL 的菌懸液0.2 mL。結(jié)果顯示：4×109CFU 的菌量只引發(fā)個(gè)別小鼠死亡，說明該菌致死性不強(qiáng)；有22 株菌腹腔注射后導(dǎo)致試驗(yàn)小鼠出現(xiàn)明顯癥狀，包括全身炸毛、飲欲食欲下降、扎堆、嗜睡等，腹瀉現(xiàn)象不明顯，有的小鼠排出軟便。采集試驗(yàn)小鼠的糞便樣品直接劃板，結(jié)果從14 組有癥狀的小鼠糞便中分離到該菌，而沒有明顯癥狀的小鼠則未分離到該菌，說明特定菌株能在腸道內(nèi)定殖，導(dǎo)致在腸道內(nèi)長(zhǎng)期帶菌和排菌。對(duì)病死小鼠剖檢發(fā)現(xiàn)，其肝臟表面和實(shí)質(zhì)散布有灰白色壞死點(diǎn)或出血點(diǎn)，有的小鼠還表現(xiàn)盲腸鼓氣（圖7）。接種攜帶毒力基因種類多的菌株的小鼠發(fā)病率較高，說明毒力基因與細(xì)菌致病力有一定聯(lián)系。

3 討論

近年來，彎曲桿菌病的高發(fā)及其耐藥性的顯著增強(qiáng)已引起各國(guó)研究人員廣泛關(guān)注。本試驗(yàn)利用PCR 方法對(duì)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)和屠宰環(huán)節(jié)肉雞中的空腸彎曲桿菌進(jìn)行了鑒定，陽(yáng)性率為40.17%，與周倩等[7-8]的報(bào)道相符合。采用微量肉湯稀釋法對(duì)獲得菌株進(jìn)行耐藥試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，獲得菌株對(duì)環(huán)丙沙星、四環(huán)素、萘啶酸的耐藥性非常嚴(yán)重，耐藥率均在90%以上，這與韓新鋒等[9-10]的報(bào)道相符合；屠宰環(huán)節(jié)獲得菌株對(duì)阿奇霉素、紅霉素、泰利霉素的耐藥情況好于養(yǎng)殖環(huán)節(jié)。氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物是治療彎曲桿菌感染的最常用藥物[11]，耐藥菌株或者耐藥因子沿著生產(chǎn)鏈和食物鏈進(jìn)入消費(fèi)者體內(nèi)的概率較大，應(yīng)引起高度重視。

241 株雞源空腸彎曲桿菌毒力基因攜帶率較高，99%分離菌株所攜帶毒力基因數(shù)都超過10 種，表明毒力基因廣泛存在于空腸彎曲桿菌中[12]，而與菌株的分布關(guān)系不大。進(jìn)一步對(duì)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)和屠宰環(huán)節(jié)分離菌株的毒力基因攜帶情況比較發(fā)現(xiàn)，neuB1、cfrA、cdtA和grpE4 種毒力基因攜帶情況存在差異，其他毒力基因差異不明顯。養(yǎng)殖環(huán)節(jié)分離株毒力基因攜帶率較高，推測(cè)這可能與雞的生長(zhǎng)階段有關(guān)；此外，本試驗(yàn)菌株均未攜帶VirBII基因，低于劉珮琪等[13]報(bào)道的數(shù)據(jù)，說明該毒力基因可能與區(qū)域分布有一定關(guān)系。

空腸彎曲桿菌有較多的毒力基因攜帶情況，但是對(duì)宿主（本試驗(yàn)中的肉雞）并不致病，可能因?yàn)樵摼鷮?duì)動(dòng)物的致病性由多種因素引起，可見空腸彎曲桿菌毒力基因在對(duì)動(dòng)物致病過程中的作用還需進(jìn)一步研究和探討。該菌毒力基因分布的相似性提示，無論從何種環(huán)境和宿主分離的空腸彎曲桿菌，都具有引起空腸彎曲桿菌病的潛在危害，若消費(fèi)者接觸被該菌污染而未經(jīng)加工的食品，很容易造成感染，故應(yīng)加強(qiáng)動(dòng)物產(chǎn)品各生產(chǎn)環(huán)節(jié)質(zhì)量安全控制，保證動(dòng)物源食品安全；同時(shí)，加強(qiáng)空腸彎曲桿菌及其毒力基因檢測(cè)對(duì)空腸彎曲桿菌病防控具有重要意義。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，從健康動(dòng)物分離到的空腸彎曲桿菌具有一定致病性，但致病性力不強(qiáng)，提示可能還有其他因素導(dǎo)致該菌具有致病性，需加強(qiáng)監(jiān)測(cè)并進(jìn)一步探索。