禽星狀病毒研究進展

張富友，鄧春冉，王素春，于曉慧，蔣文明，尹 馨，李金平，王楷宬，劉華雷，徐麗娜，李 陽

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038）

禽星狀病毒（avian astrovirus，AAstV）屬于星狀病毒科，包含多種亞型，是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的重要病原。AAstV 包括禽腎炎病毒（avian nephritis virus，ANV）、鴨星狀病毒（duck astrovirus，DAstV）、雞星狀病毒（chicken astrovirus，CAstV）、鵝星狀病毒（goose astrovirus，GoAstV）等，不僅影響家禽生產(chǎn)性能，還會引發(fā)雛雞腎炎、鴨病毒性肝炎、腹瀉、發(fā)育遲緩綜合征和痛風等癥狀，同時具有感染人的潛在危害。近年來，AAstV 在全世界大范圍流行，在我國也時有發(fā)生，如2017 年山東、江蘇等多個地區(qū)暴發(fā)以新型GoAstV 為主要病原的雛鵝內(nèi)臟型痛風病，估計造成的經(jīng)濟損失超過10 億元[1]。此外，CAstV、DAstV-CPH 等新流行株的出現(xiàn)，也給該病防控帶來較大挑戰(zhàn)。本文圍繞AAstV 病原學、流行病學、感染后臨床癥狀、致病機制以及檢測方法和控制措施等方面進行了闡述，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 病原學

1.1 病毒分類

截止到2019 年，國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將星狀病毒科分成2 個病毒屬，即哺乳動物星狀病毒屬（Mamastrovirus）和禽星狀病毒屬（Avastrovirus）[2]。AAstV 又分為3 個種（AAstV-1～3）7 個基因型，其中AAstV-1 包含火雞星狀病毒1型（TAstV-1），AAstV-2 包含禽腎炎病毒1 型（ANV-1）、2 型（ANV-2）、3 型（ANV-3）和CAstV，AAstV-3 包含火雞星狀病毒2 型（TAstV-2）、3 型（TAstV-3）和DAstV[3]。GoAstV、DAstVCPH 株和鴿源禽星狀病毒等還未被明確分類。除此之外，有研究[4]根據(jù)CAstV 的衣殼蛋白基因序列差異，將其分為A 型和B 型，其中A 型可以分為A Ⅰ、A Ⅱ和A Ⅲ三個型，B 型可以分為B Ⅰ和B Ⅱ兩個型。

1.2 病毒基因組結(jié)構(gòu)

AAstV 是一種圓形、無囊膜的單股正鏈RNA病毒，直徑25～35 nm，基因組全長6.1～7.9 kb[5]，包含兩側(cè)的5'和3'非編碼區(qū)（UTR），3 個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b 和ORF2），1 個多聚核苷酸尾巴poly（A）。ORF1b 的下游與ORF1a 有一段12～45 nt 的重疊區(qū)域，該部分包含1 個莖環(huán)結(jié)構(gòu)和核糖體移碼信號（AAAAAC）[6]。ORF1a、ORF1b 分別編碼絲氨酸蛋白酶和RNA 依賴性RNA 聚合酶（RdRp）[7]，ORF2 編碼結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白前體）[8]。ORF2N 末端的415 個氨基酸高度保守，其余部分為多變區(qū)域[9-10]。ORF2 區(qū)域存在病毒中和抗原決定簇[11-12]，其編碼的衣殼蛋白可能是病毒抗原性和細胞嗜性的主要決定因素，繼而影響發(fā)病機制和致病性。星狀病毒全基因組結(jié)構(gòu)見圖1[13]。

不同AAstV 的基因組存在一定差異。多數(shù)AAstV 的ORF1a 位于+1 讀框，ORF1b 與ORF2位于+2 讀框內(nèi)，如火雞星狀病毒（TAstV）；禽腎炎星狀病毒ORF2 與ORF1a 位于+1 讀框，ORF1b 位于+2 讀框；而鴨星狀病毒1 型（DAstV-1）的ORF1a、ORF1b 與ORF2 分別位于不同的讀框中[9，14-15]。TAstV-2、DAstV 等星狀病毒衣殼蛋白N 端含有32～35 個堿性氨基酸，同時包含1 個保守的SRSRSRSRSR 基序，而TAstV-1 和ANV衣殼蛋白N 端的堿性氨基酸為23～25 個，但是不包含重復的SR 基序[16]。除TAstV-2 外，已知AAstV 的3'UTR 均含有一段高度保守的s2m序列，可以形成與病毒全基因組復制密切相關的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[17]。

2 流行病學

AAstV 分布廣泛，宿主范圍廣，大部分禽類對其易感。AAstV 可通過污染的食物、水源或者工具等進行水平傳播，也可從卵到子代進行垂直傳播。在火雞、珍珠雞、鴨和水貂之間也存在星狀病毒種間傳播[14，18-19]。研究[20]顯示，克羅地亞某農(nóng)場30 日齡幼鴨和死胚中檢測到ANV。另外研究[21]顯示，AAstV 還存在傳染給人的風險。在肯尼亞和岡比亞兒童糞便中檢測到的星狀病毒與ANV 序列同源性超過90%。此外，在參與調(diào)查的從事火雞養(yǎng)殖屠宰等工作的人員中，約有26%表現(xiàn)為TAstV-2 血清抗體陽性[22]。

2.1 國外流行情況

DAstV 是最早被發(fā)現(xiàn)的AAstV。早在1965年，疑似DAstV 感染引發(fā)病毒性肝炎的案例就已被報道[23]。1983—1984 年，英國3 個鴨場發(fā)生了DAstV 引發(fā)的病毒性肝炎[24-25]。直到1985 年，該病毒才被定為鴨肝炎病毒2 型[24]，即DAstV-1。1969 年Toth 等[26]在死亡雛鴨的肝臟中發(fā)現(xiàn)了另一種鴨肝炎病毒（DHV），其引發(fā)的肝臟病變與其他已知的DHV 不完全相同，故將其定為鴨星狀病毒3 型（DAstV-3）。在1975 年，該病例再次發(fā)生[27]。2009 年，Todd 等[28]將其定為鴨星狀病毒2型（DAstV-2）。

ANV 最初于1976 年從雛雞的腎細胞中被分離到，并被歸類為微小核糖酸病毒[29]。直到2000年，其完整的基因組被克隆測序，序列分析發(fā)現(xiàn)ANV是星狀病毒的一個新成員[30]。此后，ANV 在各地被陸續(xù)報道出來。2002—2005 年，匈牙利部分農(nóng)場中4～22 日齡的雞出現(xiàn)腹瀉、發(fā)育遲緩綜合征和間質(zhì)性腎炎等癥狀，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測發(fā)現(xiàn)接近70%農(nóng)場的雞群為ANV 核酸陽性[31]。2010 年，在澳大利亞同樣癥狀的雞群中也出現(xiàn)ANV 感染。2010—2016 年，研究者在巴西出現(xiàn)間質(zhì)性腎炎癥狀的雞群和火雞群中檢測到了ANV[32-35]。

1990 年，研究者利用電鏡在雞糞中發(fā)現(xiàn)了CAstV[36]。Smyth[37]于2004 年從患有發(fā)育遲緩綜合征（RSS）的生長不均勻的肉雞中發(fā)現(xiàn)了CAstV。2006 年，Pantin-Jackwood 等[38]從美國有生長發(fā)育問題的肉雞中檢測到CAstV。Oluwayelu 等[39]從尼日利亞雞血清中發(fā)現(xiàn)CAstV 抗體，從而證實在非洲已經(jīng)存在該病毒。Palomino-Tapia 等[40]于2014—2019 年從死胚和雛雞的肝臟和腸道中檢測到CAstV。2016 年，在印度的肉種雞場，同樣發(fā)現(xiàn)了CAstV[41]。

2.2 國內(nèi)流行情況

2013 年，劉寧等[42]從剛出殼雛鴨中檢測到DAstV-CPH 株，并從種蛋、雛鴨和成年鴨等樣品中均檢測到該毒株。2009 年，F(xiàn)u 等[14]、Chen等[43]分別從某發(fā)病鴨場中分離到DAstV-1。2011年，研究人員在北京鴨糞便和腸道樣品中也檢測到DAstV[44]。2012—2014 年，Liu 等[45-46]陸續(xù)從發(fā)病的櫻桃谷鴨和雛鴨中分離到DAstV-2 和DAstV-3。

Xue 等[47]從我國各地區(qū)雞血清中檢測到CAstV 抗體陽性，韓濤[48]等在我國各地區(qū)地方品種雞的血清樣品中檢測到CAstV 抗體。Xue等[2]2016—2018 年從我國8 個省份AAstVs 抗體陽性雞組織樣本中分離到15 株AAstV-1 和27 株AAstV-2。

GAstV 在近幾年被發(fā)現(xiàn)并得到人們重視。2014 年，多位研究者在我國不同省份的養(yǎng)鵝主產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)GoAstV 感染的案例[49-52]，表明GoAstV 可能已波及多地。Chen 等[53]和Wei 等[54]從櫻桃谷鴨中發(fā)現(xiàn)GoAstV，表明GoAstV存在種間感染情況。

3 臨床癥狀及致病機理

AAstV 可感染多種家禽，引起禽類腹瀉。在禽類中，星狀病毒感染更多表現(xiàn)為腸道和其他內(nèi)臟器官疾病，如間質(zhì)性腎炎、鴨病毒性肝炎以及火雞腸炎和火雞腹瀉等，從而引發(fā)各種不同的臨床癥狀。AAstV 的致病機理仍不清楚，只有部分TAstV 引發(fā)腸炎的致病機制研究可作參考[55]。

CAstV 主要引發(fā)矮小、RSS、禽腸炎死亡率綜合征、腎臟損傷、腹瀉和“白雛雞”疾病。RSS為一種生產(chǎn)性疾病，表現(xiàn)為雛雞群體發(fā)育遲緩，體重增加不佳，這與因腸囊腫減少了養(yǎng)分的吸收而引發(fā)生長緩慢相吻合。CAstV 和其他腸道病毒同時感染后，會引起腸道環(huán)境異常，進而導致腸道菌群失調(diào)，自然定居菌失衡[56]。另一方面，CAstV 在雞群中普遍存在并廣泛傳播，一定程度上可以被視為正常微生物系統(tǒng)的一部分在環(huán)境變化后，微生物系統(tǒng)發(fā)生變化，從而破壞了病毒的平衡，導致出現(xiàn)RSS 等情況[37]。通過CAstV 分離株人工攻毒試驗發(fā)現(xiàn)，CAstV 可損傷雛雞腸道，改變絨毛和隱窩的比例。“白雛雞”病表現(xiàn)為一種孵化疾病，孵化出的小雞羽毛蒼白，虛弱矮小，不能長久存活，腎臟和肝臟受損傷，此外中后期胚胎死亡率和孵化率降低[57-59]。基因組對比分析顯示，引發(fā)“白雛雞”病的毒株在ORF2 區(qū)域高度相似，該疾病的嚴重性差異可能與基因組差異有關[60]。

DAstV 感染初期表現(xiàn)厭食、精神不佳，繼而轉(zhuǎn)為神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)運動失調(diào)、角弓反張[61]，剖檢可見肝臟、腎臟等腫大，有出血性病變等[62]。GoAstV 感染則以痛風、腎臟腫大和出血為主要癥狀[51]。但是，人們對于DAstV 和GoAstV 的致病機制仍缺乏相關了解。

火雞感染星狀病毒后，主要表現(xiàn)為腹瀉，但研究發(fā)現(xiàn)星狀病毒并非因破壞腸上皮細胞或引發(fā)炎癥而導致腹瀉。目前，認為TAstV 感染火雞并引發(fā)腹瀉的方式有三種：一是TAstV 感染誘導鈉吸收不良而腹瀉[63]；二是TAstV 感染導致糖消化吸收障礙而腹瀉[64-65]；三是因為TAstV 衣殼蛋白是一種腸毒素，可改變腸道屏障通透性和腸上皮細胞分布，進而引發(fā)腹瀉[66]。此外，研究[67]表明，火雞感染星狀病毒后，自身免疫抑制因子TGF-β 活性得到增強，從而抑制了機體的炎癥反應。

4 檢測方法

4.1 電鏡檢測

電鏡已被普及應用于某些動物病毒快速檢測當中。尤其是在一些新發(fā)現(xiàn)的病毒檢測中，該技術的優(yōu)勢更加突出。因為星狀病毒特有的五角或六角星狀特征，所以研究人員通過電鏡從下痢的火雞腸道中發(fā)現(xiàn)了星狀病毒粒子[25，36，68]。此后一段時間內(nèi)，電鏡成為檢測星狀病毒的主要手段[69]。但是電鏡檢測過分依賴病毒特征，直接觀察準確性低，適用于單個或少量樣品。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA 方法是一種免疫測定方法，利用抗原抗體結(jié)合對免疫反應進行定性或者定量分析。Herrmand 等[70]成功制備星狀病毒單抗，并建立EIA 和ELISA 方法。荷蘭BioChek 公司研制出針對CAstV B 群的ELISA 抗體檢測試劑盒。Tang 等[71]利用ELISA 方法對兩種血清型的TAstV 進行了交叉反應，證實了不同血清型的TAstV 具有相同的抗原。Wang 等[72]在大腸桿菌中表達了DAstV的ORF2 蛋白c 端，構(gòu)建了間接ELISA 方法。Tang 等[73]建立了多克隆AC-ELISA 和單克隆ACELISA，前者具有更高的靈敏度和更寬的檢測譜，后者特異性較高，但是靈敏度較低。Skibinska等[74]開發(fā)了用于檢測雞血清中CAstV 的間接ELISA 方法。

4.3 細胞培養(yǎng)和病毒分離

病毒分離培養(yǎng)是病毒研究中重要的一個環(huán)節(jié)，對毒株感染機制和發(fā)病機理等的深入研究以及疾病防治、疫苗和藥物研究有重要意義。雞胚或鴨胚接種、細胞培養(yǎng)是常用的病毒增殖方法。AAstV 不易在體外復制，目前使用雞胚腎細胞（CEK）或雞肝癌細胞系（LMH）可以實現(xiàn)AAstV 的分離，但是病毒增殖效率較低。Wei 等[75]利用LMH 細胞，從商品鴨中分離到新型GoAstV。Nunez 等[76-77]通過卵黃囊接種SPF 雞胚，分離到CAstV 和ANV。Liu 等[78]將鴨組織樣品接種到鴨胚的絨毛尿囊膜中，成功分離到DAstV-CPH 株。Zhang 等[79]通過鵝胚絨毛尿囊膜接種方式，從1 個養(yǎng)鵝場中分離到AAstV SD01 株。Patel 等[41]通過接種SPF 雞胚尿囊腔，從印度受感染的肉雞中分離到CAstV。

4.4 分子技術檢測方法

分子技術檢測方法是目前應用范圍最廣、最普遍的方法，最常用的有RT-PCR、熒光定量PCR以及環(huán)介導等溫擴增（LAMP）等。Wan 等[80]根據(jù)RdRp 序列建立了針對新型GoAstV 的TaqMan RT-qPCR 方法。Yin 等[81]針對新型GoAstV ORF2區(qū)域設計新型GoAstV 的檢測引物和TaqMan 探針。Jindal 等[82]針對禽輪狀病毒NSP4 基因、TAstV-2聚合酶基因和禽呼腸孤病毒S4 保守區(qū)域建立了多重RT-PCR 方法。Day 等[83]建立了用于鑒別TAstV-1、TAstV-2、CAstV、ANV 和禽輪狀病毒的多重RT-PCR。Smyth 等[84]建立了用于檢測ANV和CAstV 的實時TaqMan RT-qPCR 方法。He 等[85]針對新型GoAstV ORF1a 基因開發(fā)了一種定量LAMP 方法。Yu 等[86]建立了針對GAstV 的ORF2基因的RT-LAMP 方法。Ji 等[87]針對新型GoAstV ORF1b 基因建立了一種RT-LAMP 方法。

此外，考慮到試驗過程中操作誤差、核酸提取后抑制物殘留等問題，徐蕾蕊等[88]致力于研發(fā)星狀病毒核酸檢測標準物質(zhì)，以期望保證檢測結(jié)果的可靠性和核酸擴增檢測的質(zhì)量。

5 防治

星狀病毒血清型較多，又缺少適合增殖的胚胎或細胞系，因而弱毒或滅活疫苗產(chǎn)品較少[37]，目前所試驗的滅活苗或者亞單位疫苗只針對某個血清型，還沒有可以適用于大多數(shù)星狀病毒的疫苗問世。近年來，越來越多新型星狀病毒被發(fā)現(xiàn)，而且病毒的環(huán)境穩(wěn)定性強，對消毒劑的耐受力強。星狀病毒不止經(jīng)糞-口途徑水平傳播，還可以垂直傳播，對其凈化和控制帶了較大困難。除此之外，星狀病毒存在較嚴重的重組現(xiàn)象，使得對病毒的研究更加復雜。

Toth 等[26]將滅活疫苗免疫接種產(chǎn)蛋種鴨，使雛鴨產(chǎn)生一定的抗DAstV-2 能力。另外利用重組衣殼蛋白作為亞單位疫苗也可以產(chǎn)生良好的免疫效果[89-90]。Bassetto 等[91]提出了針對腹瀉病毒的聚合酶作為開發(fā)單一廣譜抗病毒藥物的設想，這是因為病毒與聚合酶保持相同的總體結(jié)構(gòu)和功能性基序，是出色的抗病毒靶標。針對皰疹病毒等開發(fā)的抗病毒劑證明了該蛋白是鑒定廣譜抗病毒劑的最適選擇，可以同時阻斷大多數(shù)甚至所有腹瀉誘導性病毒的復制。這為開發(fā)新的抗星狀病毒藥物提供了新思路。

6 小結(jié)

近幾年，AAstV 給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大沖擊，如以引起痛風為主要特征的GoAstV 在我國多個省份發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。雖然AAstV相關研究已經(jīng)取得較大成果，如新型AAstV 的發(fā)現(xiàn)、分類標準的完善、新的跨宿主傳播方式的發(fā)現(xiàn)等，對進一步研究提供了非常有價值的參考資料。但是AAstV 亞型多，宿主范圍廣，具有跨種間傳播甚至人獸共患的風險，合適的動物模型較少，致病機制不明，藥物研發(fā)存在較大難度，檢測方法仍需進一步完善，傳染給人類的證據(jù)不夠充分等。這些問題亟待解決，需要進一步加強對AAstV 的研究。