鴨坦布蘇病毒快速實時熒光RT-LAMP方法的建立及初步應用

王巧萍，粟柯衡，元正菊，常志順，張 薇，張以芳，信愛國

（1.云南農業大學動物醫學院，云南昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫科學院養禽與禽病研究所，云南昆明 650224；3.云南瑞栢泰生物科技有限公司，云南昆明 650041）

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）引起的一種發病急、傳播快的傳染性疾病[1]。DTMUV 最初于1955 年在馬來西亞吉隆坡的庫蚊體內被分離到，主要引起蛋鴨產蛋率以及種蛋受精率和孵化率下降，生長速度降低，部分病鴨出現神經癥狀[2]，甚至死亡。DTMUV 的宿主范圍廣泛，所有品種的鴨、鵝、雞、麻雀、鴿子[3]等均可被感染。DTMUV 接種于小鼠顱內后，小鼠的發病癥狀與禽類相似[4]。DTMUV 屬于黃病毒科黃病毒屬Ntaya 病毒群，而黃病毒科的許多成員如登革熱病毒、森林腦炎病毒、乙腦病毒等都對人類健康構成威脅[5]。鴨坦布蘇病毒病也具有公共衛生學意義，從養鴨場員工的血清中可檢出DTMUV 抗體，說明該病毒能夠在人與鴨之間傳播[6]。臨床發現本病造成的死亡率雖然較低[7]，但感染DTMUV 的鴨會因繼發其他機會致病菌感染而死亡。迄今為止，DTMUV 給我國養鴨業造成了至少數十億元的損失[8]。

DTMUV 引起的臨床癥狀不特異，與高致病性禽流感病毒等病原微生物引起的癥狀類似。用于診斷DTMUV的方法有病毒分離鑒定、血清學診斷、核酸檢測技術等。病毒分離鑒定試驗周期長、操作復雜，血清學檢測中的ELISA 需要酶標儀等儀器設備，而核酸檢測中的qRT-PCR 和普通RT-PCR對設備和操作人員的技術水平要求高，花費時間長，不適合樣品的快速和大規模檢測。因此，建立一種能快速檢測DTMUV 的方法顯得尤為重要。逆轉錄環介導等溫擴增（reverse transcription loopmediated isothermal amplification，RT-LAMP）是一種新型核酸擴增技術，根據靶基因的6 個區域設計特異性引物，在體系中加入有強鏈置換活性功能的BstDNA 聚合酶，可以實現等溫條件下核酸的指數型擴增，現已廣泛應用于多種病原微生物的檢測[9]。目前，RT-LAMP 的檢測結果多通過瓊脂糖凝膠電泳、濁度法、SYBR Green I 染料法等進行肉眼觀察，判斷不夠準確，且容易發生污染。本試驗根據DTMUVNS5基因設計引物，通過優化反應條件，建立了一種檢測DTMUV 的熒光RT-LAMP檢測方法，為DTMUV 的實驗室臨床檢測和流行病學調查提供了有效手段。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

DTMUV、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、I 型鴨肝炎病毒（duck hepatitis virus I，DHV-I）、III 型鴨肝炎病毒（duck hepatitis virus III，DHV-III）、傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）、7 日齡建水黃褐鴨，均由云南省畜牧獸醫科學院養禽與禽病研究所提供；禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H5、H7、H9 亞型抗原，購自華南農大生物藥品有限公司；

RNA 提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA/DNA Extraction Kit，購自寶生物工程（大連）有限公司；FastKing RT Kit（With gDNase）FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 試劑（2×SanTaqPCR Mix）購自上海生工生物技術有限公司；等溫擴增試劑Isothermal Master Mix（IMM），購于英國OptiGenie Limited 公司；Genie II 等溫擴增熒光檢測系統，由云南瑞栢泰生物科技有限公司提供。

1.2 引物設計與合成

采用VectorNTI 8.0 序列分析軟件，對已發表的DTMUVNS5基因（登錄號為KJ958533）保守序列進行對比分析，利用Lamp designer 軟件設計熒光RT-LAMP 引物，包含1 對外引物（正向外引物DTMUV-F3 和反向外引物DTMUV-B3）、1 對內引物（正向內引物DTMUV-FIP 和反向內引物DTMUV-BIP）和1 對環引物（正向環引物DTMUV-LF 和反向環引物DTMUV-LB）。所有引物序列詳見表1，引物由碩擎生物科技有限公司合成。

表1 DTMUV 引物信息

1.3 病毒核酸提取及反轉錄

按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA/DNA Extraction Kit 說明書提取DTMUV 及其他病毒核酸，用核酸定量儀測定濃度，按FastKing RT Kit（With gDNase）FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書將RNA 反轉錄為cDNA。將cDNA 于-20 ℃保存，RNA 于-80 ℃保存備用。

1.4 普通RT-PCR 和qRT-PCR 擴增

普通RT-PCR 反應體系為25.0 μL，包括2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL，RNase-free ddH2O 9.5 μL，上下游引物（濃度均為10 pmol/L）各1.0 μL，cDNA 1.0 μL。反應程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環；72 ℃ 7 min，最后4 ℃冷卻。PCR 結束后取5.0 μL產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠成像系統觀察結果。

qRT-PCR 的反應體系及反應條件等相關信息參考文獻[10]。

1.5 熒光RT-LAMP 方法的建立

試驗采用25.0 μL 反應體系，包括Isothermal Master Mix（IMM）等溫擴增試劑15.0 μL，DTMUV-F3（5 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-B3（5 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-BIP（40 μmol/L）1.0 μL，DTMUVFIP（40 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-LB（20 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-LF（20 μmol/L）1.0 μL，cDNA 2.0 μL，RNase-free ddH2O 2.0 μL。將反應管置于Genie Ⅱ等溫擴增熒光檢測系統中，反應程序為，65 ℃ 30 min，退火從98～80 ℃，0.05 ℃/s。在體系的基礎上，根據引物的Tm 值將溫度按照54、56、58、60、62、64、66、68 ℃依次遞增，反應時間按照20、25、30 min 多次重復，反應結束后觀察擴增曲線，出現“S”型擴增曲線為陽性，否則為陰性。

1.6 熒光RT-LAMP 特異性試驗

用確定的最佳試驗條件分別對DTMUV 陽性樣品及其他幾種病毒cDNA 進行熒光RT-LAMP 檢測，觀察擴增曲線以明確該方法是否與其他禽類病毒存在交叉反應，從而評價該方法的特異性。

1.7 熒光RT-LAMP 敏感性試驗

將DTMUV cDNA 用RNase-free ddH2O 連 續10 倍倍比稀釋作為檢測樣品，按最佳試驗條件進行熒光RT-LAMP 擴增，測定模板最低檢出量，以判定該方法的敏感性。同時將其與普通RT-PCR 和qRT-PCR 敏感性進行比較。

1.8 熒光RT-LAMP 重復性試驗

將同一批次的DTMUV 細胞毒cDNA 分裝成3 份，-20 ℃保存。在同一天的3、6、9 h 分別進行熒光RT-LAMP 重復檢測，每個樣品做3 個重復，此為批內重復性試驗；在試驗的第1、3、5 天分別提取RNA 并反轉錄為cDNA 后進行熒光RTLAMP 檢測，每個樣品做3 個平行重復，此為批間重復性試驗。

1.9 熒光RT-LAMP 的初步應用

經測定，DTMUV 滴度為103.7TCID50/0.1 mL。將40 只7 日齡建水黃褐鴨平均分成4 組。其中，3組為試驗組，分別按照0.1 mL/只腿肌注射接種原液（103.7TCID50）以及10-1稀釋（102.7TCID50）和10-2稀釋（101.7TCID50）的病毒液，1 組為對照組，注入等體積滅菌PBS。攻毒5 d 后處死各組鴨，分別采集每只鴨肝臟作為檢測樣品，提取樣品RNA并反轉錄為cDNA 進行熒光RT-LAMP 檢測，同時用普通RT-PCR 和qRT-PCR 進行檢測并比較陽性檢出率。

2 結果

2.1 熒光RT-LAMP 溫度篩選

經過條件優化，最適反應溫度為64～66 ℃，65 ℃為最佳（圖1）。

2.2 熒光RT-LAMP 特異性試驗

將DTMUV 與NDV、DHV-I、DHV-III、IBDV 以 及AIV 亞型抗原（H5、H7、H9）的cDNA 在最佳反應條件下進行擴增。結果顯示，僅DTMUV 有“S”型擴增曲線（圖2），產生尖峰狀特異性熔解曲線（圖3），而其他幾種病毒cDNA 均無擴增曲線。

2.3 熒光RT-LAMP 敏感性試驗及反應時間篩選

將DTMUV 的cDNA（原始質量濃度為9 ng/μL）用RNase-free ddH2O 連續10 倍梯度稀釋作為模板進行熒光RT-LAMP 反應。結果發現，熒光RT-LAMP的最低檢測限為10-5稀釋度，即9×10-2pg/μL，換算成拷貝數為4×102copies/μL；觀察敏感性試驗擴增曲線可知，25 min 之后為擴增曲線的平臺期，20 min 時部分擴增曲線未達平臺期，取25 min 為最佳反應時間（圖4）；敏感性試驗的熔解曲線均為90.5～90.7 ℃，最大誤差為0.2 ℃，誤差率為0.2%，屬于試驗誤差（圖5）；qRT-PCR 的檢測限為10-5稀釋度，即9×10-2pg/μL，換算成拷貝數為4×102copies/μL（圖6）；普通RT-PCR 的檢測限為10-3稀釋度，即9 pg/μL，換算為拷貝數為4×104copies/μL（圖7）。結果表明，熒光RT-LAMP 方法的敏感性與qRT-PCR 方法一致，是普通RT-PCR 的100 倍。

2.4 熒光RT-LAMP 重復性試驗結果

DTMUV cDNA 的批內重復性試驗結果顯示，在3 h（圖8）、6 h（圖9）、9 h（圖10）的結果均為陽性；批間重復性試驗的結果顯示，在第1 天（圖11）、3 天（圖12）、5 天（圖13）的結果均為陽性，表明本方法重復性良好。

2.5 人工感染樣品檢測

將人工感染劑量為103.7、102.7、101.7TCID50的鴨組織采用熒光RT-LAMP、qRT-PCR 和普通RT-PCR 分別進行檢測。結果（表2）顯示，熒光RT-LAMP 和qRT-PCR 的檢測結果接近，普通RT-PCR 檢出率最低。

3 討論

本試驗針對DTMUVNS5基因建立的熒光RT-LAMP 方法是將熒光染料插入擴增產物的雙鏈DNA 中，產生并發散熒光信號，熒光信號的累積與LAMP 產物的形成同步，結果可通過讀取擴增曲線，同時觀察熔解曲線判斷是否為特異性擴增，實現對樣品的快速、全封閉式檢測，避免氣溶膠污染和假陽性。相對于目前常規采用瓊脂糖凝膠電泳、濁度法、SYBR Green I 染料法、鈣黃綠素顯色法或者羥基萘酚藍（HNB）等使用肉眼觀察的RT-LAMP 方法，熒光RT-LAMP 方法具有明顯的優勢。

試驗根據熔解曲線和Tm 值對反應時間和溫度進行優化，避免非特異性擴增和引物二聚體對試驗結果造成的干擾，結果判定具有客觀性和可靠性。目前國內學者建立的DTMUV RT-LAMP 檢測方法[11-14]擴增時間均超過45 min，普通RT-PCR 需2 h，qRT-PCR 需1 h，而本試驗建立的熒光RTLAMP方法僅需25 min，即可實現核酸的快速擴增，適合大規模樣品檢測。該方法具有良好的特異性，NDV、DHV-I、DHV-III、IBDV、AIV 亞 型H5、H7、H9 抗原的核酸均不能檢出，而檢測DTMUV的熔解曲線呈尖峰狀，說明產物單一，特異性良好。批內和批間重復性結果證明其重復性良好。敏感性方面，對于同一份cDNA 樣品，熒光RT-LAMP和qRT-PCR 的最低檢測限均為9×10-2pg/μL，即4×102copies/μL，普通RT-PCR 的檢測限為9 pg/μL，即4×104copies/μL，熒光RT-LAMP 方法的敏感性與qRT-PCR 方法一致，是普通RT-PCR 的100倍，說明熒光RT-LAMP 的敏感性良好，且其敏感性高于其他學者對DTMUV 建立的RT-LAMP方法[15-16]。初步應用該方法，檢測人工接種試驗鴨的肝臟，對感染劑量為103.7TCID50的樣品，熒光RT-LAMP、qRT-PCR 和普通RT-PCR 陽性檢出率均為100%（10/10）；對感染劑量為102.7TCID50的樣品，熒光RT-LAMP 和qRT-PCR 方法檢出率均為100%（10/10），普通RT-PCR 檢出率為80%（8/10）；對于感染劑量為101.7TCID50的樣品，普通RT-PCR 檢出率為50%（5/10），qRT-PCR 陽性檢出率為100%（10/10），熒光RT-LAMP 陽性檢出率為90%（9/10），說明熒光RT-LAMP 可用于組織感染樣品的檢測，且其檢出率高于普通RT-PCR，與qRT-PCR 接近。

試驗根據DTMUVNS5基因建立的熒光RT-LAMP 檢測方法具有較強的特異性、重復性和敏感性，65 ℃ 25 min 即可完成快速檢測，為DTMUV的臨床檢測和流行病學調查提供了技術支持。