改良型富血小板纖維蛋白用于口腔軟組織缺損修復對瘢痕的影響*

王 拓，黃書丹

(川北醫學院附屬醫院口腔科，四川 南充 637000)

瘢痕是創傷愈合過程中的常見并發癥，常伴增生、瘙癢、攣縮、疼痛、色素沉著及關節活動受限等不良癥狀，不僅影響組織美觀，還會引起皮膚功能障礙等，對患者的身心健康造成極大的困擾[1-2]。目前，在口腔領域中部分患者常因種植手術、牙周手術、口腔黏膜病或頜面部腫瘤性疾病導致軟組織的缺損。創傷形成后，成纖維細胞過度增殖、膠原蛋白過度合成及降解失衡、膠原纖維的不規則排列堆積，都會引起創面組織病理性纖維化，形成瘢痕組織[3]。因此，瘢痕組織的形成主要與膠原蛋白的合成有關。傳統的口腔黏膜組織缺損的修復方法包括直接牽拉縫合、鄰近黏膜瓣轉移覆蓋、血管吻合游離皮瓣移植、組織工程黏膜修復術、脫細胞真皮基質等，但具有需要增加手術區域、傷口預后效果不好、價格昂貴、有倫理顧慮及免疫原性等缺點[4-5]。改良型富血小板纖維(APRF)是由GHANAATI等[6]于 2014 年提出的第三代新型富血小板纖維蛋白，是由人體靜脈血變速離心獲得的一種血液提取物，其纖維蛋白微觀結構及機械性能、細胞分布、生長因子含量等均與富血小板纖維蛋白有所不同[7]。與富血小板纖維蛋白相比，APRF含有更高水平的血小板和血小板衍生生長因子(PDGF)。在細胞增殖實驗中，APRF顯著刺激了骨膜細胞的增殖。目前，有一些臨床試驗證實APRF能夠很好地促進口腔軟組織缺損修復再生[8-9]。但是國內外關于APRF在軟組織修復中對瘢痕組織的影響還少見報道。本研究通過建立兔硬腭區軟組織缺損模型，探討APRF對瘢痕的影響機制，為臨床上生物材料的選擇提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 選取30只健康雄性日本大耳白兔，體重2.0～2.5 kg，由四川省成都達碩實驗動物中心提供飼養及管理，生產許可證號：SYXK(川)2019-189，按照動物倫理學要求對動物進行各項處置。兔硬腭軟組織缺損模型的制備[10]，將其隨機分為兩組。(1)APRF組：將制備的自體APRF膜修剪縫合固定于傷口上；(2)空白對照組：創面不進行任何處理，任其自然愈合。

1.1.2實驗主要儀器 種植機：Surgic XT Plus(NSK公司，日本)；種植手機：Ti-SG20L(NSK公司，日本)；5.0 mm組織環切鉆(MCT公司，韓國)；纖維蛋白成型處理工具盒(Process，法國)；APRF真空無菌采血管(10 mL)等。

1.1.3兔硬腭軟組織缺損模型的建立[11]沿兔耳緣緩慢靜脈推注3%戊巴比妥鈉1 mL/kg進行麻醉，兔呈仰臥位固定于手術臺上；常規消毒，鋪洞巾；兔頭部稍后仰，以充分暴露硬腭組織，術者持接有直徑為5 mm環切鉆的種植手機，于兔硬腭前部中份(前緣距上頜后排門齒2 mm，左右距硬腭黏膜邊緣2 mm)制備軟組織缺損，剝離并去除黏骨膜直至抵達骨面。

1.2方法

1.2.1觀察指標

1.2.2大體觀察 通過形態學初步觀察兩組在各時間節點(建模7、21、28 d)形成瘢痕的情況。

1.2.3Masson染色 在各時間節點(建模3、7、14、21、28 d)每組處死3只動物后常規制作病理切片，以Masson三色染色，然后采用BA200Digital數碼三目顯微攝像系統對切片進行圖像采集，每張切片先于100×鏡下觀察，再于400×鏡下隨機選取不重疊的3個視野，以Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(Media Cybernetics公司，美國)測定所采集的3個圖像的膠原纖維平均吸光度(A)。

1.2.4酶聯免疫吸附法(ELISA) 標本切割后稱重，加入適量生理鹽水，采用標本勻漿器充分勻漿后離心(2 000～3 000 r/min，10～15 min)，收集上清液，-80 ℃保存，待測。按照兔羥脯氨酸(Hyp)、PDGF和轉化生長因子-β(TGF-β)、ELISA試劑盒說明書進行操作，繪出標準曲線(橫坐標：A值；縱坐標：標準物的濃度)，查出對應濃度，再乘以稀釋倍數，得到樣品的實際濃度，重復操作3次，取平均值，最后得到Hyp、PDGF、TGF-β1在不同時間節點(建模3、7、14、21、28 d)的實際濃度。

2 結 果

2.1大體觀察 術后7 d，APRF組膜愈合面積均可達原創面面積的1/2；空白對照組創面紅腫仍明顯，可見明顯組織凹陷缺損。術后21 d，APRF組創面黏膜色澤、質地與正常黏膜一致，空白對照組還存在少量組織凹陷，瘢痕組織明顯。術后28 d，空白對照組未見組織凹陷,但可見明顯瘢痕組織，見圖1。

2.2Masson染色結果 膠原纖維呈藍色深染，肌纖維、纖維素、肌肉、細胞質呈紅色，紅細胞呈橘紅色，胞核呈黑藍色。術后3 d，兩組膠原纖維的含量均很少。術后7 d，兩組膠原纖維迅速增多，此時膠原纖維均比較細小，排列不整齊。術后14 d，APRF組膠原纖維排列整齊、規則,空白對照組膠原纖維逐漸增多，排列仍然較紊亂。術后21 d，空白對照組膠原纖維持續增多，呈紊亂排列，APRF組膠原纖維呈減少趨勢。術后28 d，APRF組膠原纖維繼續減少，空白對照組形成大量膠原纖維，紊亂排列交織成網狀結構。見圖2。術后3 d，兩組膠原纖維平均A值比較，差異無統計學意義(P>0.05)；術后7、14 d，APRF組膠原纖維平均A值大于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；術后21 d兩組膠原纖維平均A值比較，差異無統計學意義(P>0.05)；術后28 d，APRF組膠原纖維平均A值小于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點膠原纖維平均A值比較

2.3ELISA

2.3.1Hyp定量分析 術后3、7、14 d，APRF組Hyp水平明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；術后21、28 d，兩組Hyp水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同時間點Hyp水平比較

2.3.2PDGF 術后3 d，兩組PDGF水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；術后7 d，APRF組PDGF水平高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；術后14、21、28 d，兩組PDGF水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同時間點PDGF水平比較

2.3.3TGF-β 術后3、7、14、28 d，APRF組TGF-β水平均高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同時間點TGF-β水平比較

3 討 論

本研究結果顯示，APRF組創面愈合明顯較空白對照組更快、更好，提示APRF膜可在一定程度上促進創面愈合。成纖維細胞異常增殖及膠原蛋白過度合成是瘢痕組織的主要病理學特點[3]。膠原蛋白是結締組織的重要組成部分，如果膠原蛋白合成與降解失調，導致其過度沉積，將會引起創面組織病理性纖維化，形成瘢痕組織。創面愈合過程包括炎性反應階段、肉芽形成階段、組織修復重塑3個階段，多種細胞及分子參與這個過程，其中生長因子發揮重要作用[11]。APRF屬于新型的血液提取物，可起到支架作用。已有研究發現，APRF具有比PRF更大、更疏松的纖維網狀結構，更有利于組織細胞及各種生長因子的遷徙和增殖[12]。創傷形成后，APRF中的血小板激活，釋放各種細胞因子，包括白細胞介素(IL)，如IL-1和IL-4、PDGF、TGF-β、成纖維細胞生長因子(FGF)、腫瘤壞死因子(TNF)等，這些生長因子與軟組織的愈合密切相關。在創傷愈合早期，PDGF可誘導大量的纖維母細胞到創傷區，并促進其更快地分化為成纖維細胞，成纖維細胞主要合成并分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白[13]。同時，成纖維細胞合成并分泌的基質金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)對此過程具有重要的調控作用。研究顯示，PDGF對MMPs合成及分泌具有重要的調控作用[14]。TGF-β也可促進表皮細胞、纖維母細胞遷移至創傷區。TGF-β也能雙重調控MMPs，從而調節膠原蛋白的合成與代謝[15]。TGF-β還可通過TGF-β/Smad 通路調控并啟動成纖維細胞的增殖分裂，導致膠原蛋白的大量合成，并在細胞外基質過度沉積，最終導致纖維化的組織病理學改變[16-17]。目前，有研究發現，TGF-β/Smad信號通路異常傳導與增生性瘢痕形成密切相關[18]。說明在膠原纖維的合成與降解方面，PDGF和TGF-β是2種非常重要的生長因子。Hyp是膠原蛋白的特征性表達成分，可以反映創面肉芽組織的形成情況，對創面愈合質量的評估有重要意義[20]。因此，本實驗通過ELISA測定不同時間節點Hyp、PDGF、TGF-β的實際濃度，并結合Masson染色的膠原纖維平均A值分析比較各組膠原蛋白合成與分解情況、膠原纖維形成的多少及排列情況。

從形態學方面觀察，APRF組在第14天左右已基本完成創面愈合，且基本沒有瘢痕存在，而空白對照組在28 d左右才基本完成創面愈合，存在明顯的瘢痕反應。結合Masson染色結果分析：在創傷愈合早期(術后7 d內)，兩組膠原纖維形成較少，此時的Hyp水平也較少，推測此階段膠原蛋白的含量不能交聯排列成膠原纖維。在創傷愈合中期(術后7～15 d)，羥脯氨酸含量增加，APRF組合成膠原蛋白的能力增強，且膠原纖維排列整齊且規則，而空白對照組的膠原纖維也多，但排列紊亂。結合ELISA結果分析，此階段APRF組的PDGF、TGF-β水平較空白對照組均更高，推測PDGF、TGF-β具有促進膠原蛋白之間的化學交聯反應，加快形成膠原纖維的速度。PDGF、TGF-β水平到15 d左右達最大值，15 d以后呈下降趨勢。由此可推測PDGF和TGF-β的釋放峰值可能在14 d左右。在創傷愈合后期(術后21～28 d)，Masson染色結構顯示，空白對照組的膠原纖維較多，排列紊亂，而APRF組的膠原纖維反而減少，APRF組的Hyp水平較之前明顯減少，較空白對照組均更少。而PDGF、TGF-β的水平也均較空白對照組更多，該結果出現的原因可能是由于APRF中PDGF、TGF-β水平更高，導致膠原纖維降解的速度更快，膠原蛋白總的水平更少。而空白對照組因為缺少生長因子的作用，導致膠原纖維的降解不夠，最后形成纖維化瘢痕組織，與形態學的結果相符合。在創面愈合過程中，APRF能夠很好地減少軟組織瘢痕的形成，這為APRF在軟組織缺損修復領域中的推廣應用奠定了一定的理論基礎。但由于瘢痕增生過程非常復雜，可涉及多種信號級聯反應，其具體作用機制在后續應進一步進行細胞學及分子生物學水平方面的深入研究。