牛布魯氏菌A19 號疫苗免疫血清幾種檢測方法的比較

吳小梅，李建玲，王 濤，蔡擴(kuò)軍，朱冠林，楊 鎮(zhèn)，馬小娟，高 敏，陳利蘋，鐘 旗，李愛巧

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830091；4.深圳真瑞生物科技有限公司，廣東深圳 518000；5.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

布魯氏菌病（以下簡稱布病）是由布魯氏菌（Brucella）感染而導(dǎo)致的人獸共患病，主要通過病菌侵入機(jī)體的黏膜、呼吸道等導(dǎo)致，家畜感染后主要表現(xiàn)為雌性不孕、流產(chǎn)，以及雄性睪丸炎等。隨著畜牧業(yè)發(fā)展，布病在許多國家和地區(qū)卷土重來[1]。近年來我國的畜間和人間布病病例數(shù)量逐年增多，不僅給畜牧業(yè)造成不可估量的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重危害人類健康、公共衛(wèi)生安全。各級獸醫(yī)主管部門和動物防疫機(jī)構(gòu)采取了相應(yīng)的家畜布病預(yù)防控制措施，以最終達(dá)到家畜布病凈化的目標(biāo)。

新疆是我國布病高發(fā)的一類地區(qū)。《國家布魯氏菌病防治計劃（2016—2020 年）》要求，一類地區(qū)污染嚴(yán)重的養(yǎng)殖場（戶），經(jīng)過報備后應(yīng)實(shí)施布病免疫。關(guān)于牛布病免疫后的血清學(xué)檢測方法，目前主要有虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）、熒光偏振試驗（FPA）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA）等。根據(jù)《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2018）、《新疆維吾爾自治區(qū)2021 年動物疫病免疫工作實(shí)施方案》等規(guī)定，RBT、FPA 和iELISA 用于初篩，SAT 和 cELISA 用于確診，進(jìn)而再采集cELISA、SAT 均為陽性的牛陰道拭子或奶樣進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)時熒光 PCR 及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）檢測，以確定血清學(xué)陽性牛是否仍為布魯氏菌核酸陽性。而不同檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)各不相同，如尚德秋[2]研究發(fā)現(xiàn)，SAT 存在一定的假陽性和假陰性，而且布病免疫后很難區(qū)分檢出的血清學(xué)陽性牛為感染陽性還是免疫陽性。本試驗應(yīng)用RBT、SAT、cELISA、iELISA 和 FPA 方法，對免疫布魯氏菌A19 號疫苗18 個月后的牛血清進(jìn)行布病抗體檢測，對比這5 種血清學(xué)檢測方法的敏感性、特異性、誤診率、漏診率、符合率、Kappa 值，將LAMP 與PCR 方法比對，篩選簡易、快捷、有效、科學(xué)的免疫動物布病核酸檢測方法，科學(xué)區(qū)分疫苗免疫和自然感染，這將對布病防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本 新疆烏魯木齊市送檢的 1 721份免疫布魯氏菌A19 號疫苗18 個月后的牛血清。

1.1.2 檢測試劑 布病虎紅平板凝集試驗抗原（批號202017）、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（批號201501）、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清（批號201403），布病試管凝集試驗抗原（批號202003）、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（批號201501）、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清（批號201403），均購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；iELISA 抗體檢測試劑盒（批號650112-2）、cELISA 抗體檢測試劑盒（批號20190523）、FPA 檢測診斷試劑盒（批號20201018），購自哈爾濱平河生物技術(shù)有限公司；實(shí)時熒光 PCR 檢測試劑盒（批號BRU20201019P），購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司；LAMP 檢測試劑盒（批號EP20210118），購自深圳立遠(yuǎn)生物科技有限公司

1.1.3 主要設(shè)備與耗材 恒溫培養(yǎng)箱（BPC-250F），寧波江南儀器廠產(chǎn)品；熒光偏振儀（Synery H1 HIFD）、布病便攜式熒光偏振檢測儀（FLUPO III），均為美國博騰公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀（sunrise），瑞士TECAN 公司產(chǎn)品；ABI Q5 熒光定量PCR 儀（Quant Studios 5）、恒溫混勻儀（DIgtal Shaking Drybath），均為賽默飛公司產(chǎn)品；恒溫混勻儀-加熱（HH-100），立遠(yuǎn)（深圳）生物科技有限公司產(chǎn)品；單道和多道微量移液器（eppendorf Research Plus），德國eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

RBT、SAT、iELISA、cELISA 檢測方法，參照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2018）步驟開展相關(guān)試驗操作及結(jié)果判定；FPA 檢測方法，按照新疆地方標(biāo)準(zhǔn)《牛羊布魯氏菌病熒光偏振（FPA）檢測方法》（DB65/T 4292—2020）開展試驗及結(jié)果判定；PCR 及LAMP 檢測方法，嚴(yán)格按照說明書開展相關(guān)操作和結(jié)果判定。其中：LAMP 檢測方法的樣品前處理，需要65℃滅活30 min；PCR 檢測方法的樣品前處理，需要在金屬浴中滅活，試驗需全程在生物安全柜中進(jìn)行。

本試驗采用2 種LAMP 檢測方法：一種是可視法，可以現(xiàn)場操作，將反應(yīng)管置于恒溫震蕩儀孔內(nèi)，按照設(shè)定程序運(yùn)行40 min 后取出反應(yīng)管，肉眼觀察顏色變化，判讀并記錄檢測結(jié)果。另一種熒光法，可在實(shí)驗室操作，將反應(yīng)管置于實(shí)時熒光恒溫擴(kuò)增檢測儀孔內(nèi)，點(diǎn)擊開始鍵進(jìn)行反應(yīng)，40 min反應(yīng)結(jié)束后保存并記錄檢測結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

為了更好地評價幾種檢測方法的敏感性、特異性等指標(biāo)，將SAT 檢測結(jié)果作為參比標(biāo)準(zhǔn)，分別與RBT、iELISA、cELISA 和FPA 進(jìn)行比較，將LAMP 與PCR 進(jìn)行比較，將檢測結(jié)果通過Excel軟件錄入，利用SPSS 20.0 軟件對參比試驗與診斷試驗檢測結(jié)果進(jìn)行比較。按照公式計算假陰性率、假陽性率、符合率及Kappa 值（表1）[3]。假陽性率（誤診率）=（B/N1）×100%；假陰性率（漏診率）=（C/P1）×100%；一致率（符合率/準(zhǔn)確率）=[（A+D）/S]×100%；Kappa 值={[（A+D）-[（P1P2+N1N2）/S]}/{1-[（P1P2+N1N2）/S]}。Kappa 值，是一致性統(tǒng)計指標(biāo)，能夠反映測量方法的相關(guān)程度。一般認(rèn)為：Kappa 值＜0，一致性強(qiáng)度非常差（一般在實(shí)驗室實(shí)際操作情況下發(fā)生的概率較低）；0～0.20，一致性強(qiáng)度為微弱；0.21～0.40，一致性強(qiáng)度為弱；0.41～0.60，一致性強(qiáng)度為中度；0.61～0.80，一致性強(qiáng)度為高度；0.81～1.00，一致性強(qiáng)度為極強(qiáng)[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SAT 與RBT、iELISA、cELISA、FPA 比較

依據(jù)檢測對比結(jié)果（表2），參照各評價指標(biāo)計算公式計算結(jié)果（表3），敏感性和特異性從高到低依次為iELISA、FPA、cELISA、RBT；符合率從高到低依次為iELISA、FPA、cELISA、RBT；Kappa 值方面，iELISA、cELISA、FPA、RBT 一致性均極強(qiáng)，均≥1.00。

表2 SAT 檢測結(jié)果與 RBT、iELISA、cELISA、FPA檢測結(jié)果比較 單位：份

表3 不同檢測方法準(zhǔn)確性比較

2.2 LAMP 法檢測圖譜

2.2.1 可視法 同批反應(yīng)的陽性對照，反應(yīng)后溶液顏色由紫羅蘭色變成天藍(lán)色；而陰性對照，反應(yīng)后溶液顏色仍為紫羅蘭色（圖1）。

2.2.2 熒光法 將反應(yīng)管置于實(shí)時熒光恒溫擴(kuò)增檢測儀孔內(nèi)，點(diǎn)擊開始鍵進(jìn)行反應(yīng)，40 min 反應(yīng)結(jié)束后，在實(shí)時熒光恒溫擴(kuò)增檢測儀上查看結(jié)果。結(jié)果（圖2）顯示：同批反應(yīng)的陰性質(zhì)控?zé)晒庵翟隽浚? 000 000，同批反應(yīng)的陽性質(zhì)控?zé)晒庵翟隽浚? 000 000，且有典型的S 型擴(kuò)增曲線。

2.3 LAMP 與PCR 檢測結(jié)果比較

LAMP 與PCR 比對結(jié)果（表4）顯示，LAMP方法特異性強(qiáng)、誤診率低、漏診率低，與PCR 符合率高、一致性強(qiáng)。

表4 LAMP 與PCR 準(zhǔn)確性比較

3 討論

3.1 在檢疫凈化階段優(yōu)先選擇敏感性高的ELISA檢測方法

通過試驗分析發(fā)現(xiàn)，假陽性率能夠反映檢測方法的特異性，假陽性率越低，特異性就越高。本試驗對iELISA、cELISA、FPA 這3 種血清學(xué)檢測方法進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，iELISA 敏感性較高（94.44%），漏診率最低（5.56%）。同樣也有研究[5]表明，iELISA 敏感性高，特異性也優(yōu)于RBT、SAT、FPA，但在基層實(shí)驗室實(shí)際操作應(yīng)用中血清交叉問題仍無法避免，導(dǎo)致試驗結(jié)果出現(xiàn)假陰性和假陽性，試驗人員也難以有效區(qū)分人工免疫和自然感染導(dǎo)致的陽性，因此ELISA 檢測方法可用作布病的篩查。本研究發(fā)現(xiàn)，iELISA 與SAT的Kappa 值為1，一致性極強(qiáng)。SAT 方法簡便、特異性高，所以在臨床上得到廣泛應(yīng)用，這也是我國布病確診的常用方法[6-7]。但SAT 方法檢測時間需要在37 ℃條件下孵育 18～20 h，并且結(jié)果判定方面無法避免主觀因素影響，單獨(dú)使用 SAT 檢測方法特異性較差，可能出現(xiàn)假陰/陽性情況，且無法區(qū)分人工免疫和自然感染陽性[8]。正因如此，該方法不適于現(xiàn)場應(yīng)用和大批量樣品檢測。范偉興等[1]的研究結(jié)果同樣表明，cELISA 檢測方法具有較高的特異性，可以區(qū)分自然感染和免疫陽性。李彥偉[9]研究表明，ELISA 檢測方法可鑒別絕大多數(shù)布病疫苗免疫抗體，在很大程度上可將控制布病所需時間和費(fèi)用降至最低，使得布病控制進(jìn)程得以加快。本試驗結(jié)果也顯示，cELISA 與SAT 的一致性、特異性、敏感性均較高，且操作簡便，可在養(yǎng)殖場群體檢疫時發(fā)揮重要作用，同時也是布病的確診方法。2018 年，我國現(xiàn)行的《動物布病實(shí)驗室診斷檢測技術(shù)》（GB/T 18646—2018）將ELISA（iELISA、cELISA）列入可選擇布病檢測方法中，為 ELISA 檢測技術(shù)應(yīng)用于我國布病診斷提供了有效支撐[10]。研究[11]表明，在實(shí)際檢測中，cELISA檢測方法更敏感，檢測效率高，結(jié)果更可靠。因此，在牛布病凈化中，選擇敏感性高的ELISA 檢測方法有利于及時發(fā)現(xiàn)血清學(xué)陽性牛。

3.2 理論上FPA 檢測方法可以區(qū)分疫苗免疫抗體和感染抗體

FPA 檢測方法簡便、快速、通量大，特異性和敏感性都較高，極適合于大批量牛羊布病檢疫、現(xiàn)場篩查和疫病監(jiān)控，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》第3.1.4 章布魯氏菌病第2.6 熒光偏振分析等章節(jié)對此有詳細(xì)描述。分子在溶液中作隨機(jī)轉(zhuǎn)動運(yùn)動，轉(zhuǎn)動速率與分子大小密切相關(guān)，分子越大轉(zhuǎn)動速率越慢，反之轉(zhuǎn)動速率越快。分子被熒光色素標(biāo)記后，測量水平方向和垂直方向上的偏振光強(qiáng)度，就可以確定通過角度大小為68.5°的轉(zhuǎn)動時間。大分子所發(fā)射出的偏振光比轉(zhuǎn)速較快的小分子多。診斷牛布病時，該方法是針對牛種布魯氏菌LPS 的小分子量片段（平均22 kD），用熒光素異硫氰酸酯（FITC）標(biāo)記作為抗原，先讀取1 次空白/背景值（2～3 min），再將該標(biāo)記抗原添加到稀釋的血清中，若有布魯氏菌抗體存在，標(biāo)記的抗原與抗體結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)動速度降低，然后使用熒光偏振分析儀（FPM）在添加標(biāo)記抗原后約2 min 內(nèi)測定出偏振值，通過偏振值mP 的大小，判斷樣品的陰、陽性，因此這是一種兩步分析法。

FPA 在2018 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下發(fā)的動物疫病監(jiān)測方案中被確定為初步篩查試驗。FPA 診斷方法檢測布魯氏菌的特異性和敏感性與cELISA 所得結(jié)果基本相同，而且操作簡單方便，既適合現(xiàn)場檢測，也適合實(shí)驗室檢測，可應(yīng)用于大規(guī)模動物群體布病的檢疫、篩查和凈化工作。FPA 檢測方法在一些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其同樣是檢測抗原/抗體相互作用的一種新技術(shù)，可以通過儀器設(shè)備現(xiàn)場自動化檢測，反應(yīng)時間短，且省去了洗板和孵育時間，能快速得出試驗結(jié)果并且結(jié)果是準(zhǔn)確、可靠的。本試驗也將FPA 檢測方法加入布病血清學(xué)檢測方法的比對中。FPA 檢測方法的優(yōu)點(diǎn)在本研究試驗結(jié)果中也得到充分展示，其敏感性達(dá)到94.12%，特異性達(dá)到98.24%。有研究[12]表明，F(xiàn)PA 作為篩選試驗用于布病檢測有較好的應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn)，該方法敏感性較好，漏檢率較低（5.88%），一致性和特異性均在96%以上；整個檢測過程在單個試管的溶液內(nèi)進(jìn)行，無需沉淀和洗滌，分析時間僅需幾分鐘，可以區(qū)分疫苗免疫抗體和感染抗體，并且可現(xiàn)場直接操作和判定結(jié)果。

3.3 撲殺陽性牛時，應(yīng)使用敏感性高的檢測方法并結(jié)合實(shí)際流行病學(xué)調(diào)查情況

本試驗將LAMP 與PCR 方法進(jìn)行比較，得到的結(jié)果是LAMP 與PCR 的特異性、符合率均較高，敏感性和漏診率較低，一致性強(qiáng)，沒有顯著性差異。

2016 年7 月世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布了“TB-LAMP 在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用”報告，正式推薦TB-LAMP 為結(jié)核病診斷方法，由此證明LAMP 檢測方法確實(shí)準(zhǔn)確可靠。LAMP 檢測方法所需實(shí)驗設(shè)施較少，生物安全要求較低，操作簡單快捷，可實(shí)現(xiàn)快速的即時檢測，在確認(rèn)感染動物、消滅傳染源的同時，將感染標(biāo)本限定在現(xiàn)場，避免了帶病牛污染物的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存，并且病原學(xué)試驗在BSL-2 實(shí)驗室進(jìn)行，因而降低了獸醫(yī)工作者的感染風(fēng)險；利用病原學(xué)檢測可提高動物布病檢疫的精準(zhǔn)度，及時準(zhǔn)確撲殺和處理病畜，進(jìn)而可更加高效地實(shí)施布病凈化政策。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)時熒光PCR方法的敏感性、特異性及與LAMP 的符合率均較高，漏診率僅為0.18%，一致性高。實(shí)時熒光PCR檢測試劑盒在進(jìn)行布魯氏菌分子生物學(xué)檢測時，要取得盡量精準(zhǔn)的結(jié)果，需樣本濃縮后進(jìn)行核酸純化，以純化的核酸作為擴(kuò)增模板，并且需要熒光定量PCR 儀器等特殊設(shè)備，成本較高，因而此方法不適合在基層推廣和用于現(xiàn)場檢測[13-15]。因此，在養(yǎng)殖場確定撲殺感染牛時，為避免假陽性，降低因誤殺帶來的損失，建議使用敏感性高的病原學(xué)檢測方法，同時結(jié)合牛場的流行病學(xué)調(diào)查情況確定具體檢測方法。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明：血清學(xué)檢測方法敏感性高、特異性好、漏診率低、符合率高，而分子生物學(xué)檢測方法特異性強(qiáng)、誤診率低、漏診率低。對于牛群尤其是免疫牛群的布病凈化，建議采用多種方法檢測，進(jìn)行綜合分析研判，僅用一種方法可能會存在偏差。可先用iELISA 或FPA 或RBT 進(jìn)行初篩，再用cELISA 或SAT 進(jìn)行確診，進(jìn)而對確診的陽性牛再進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，以避免假陽性，降低因誤殺帶來的損失。