微生物菌群培養(yǎng)組學(xué)在動物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

楊玉潔

【摘要】近年來，培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展使得可培養(yǎng)的人體細菌庫劇增，人們對宿主-細菌之間相互作用關(guān)系的認知進一步加深。培養(yǎng)組學(xué)在動物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用使可培養(yǎng)的細菌大量增加，在臨床致病菌分離鑒定中發(fā)現(xiàn)了新的分類群，且減少了在宏基因組學(xué)研究中的尚未明確分配的操作分類單元。本篇綜述在介紹培養(yǎng)組學(xué)研究方法的同時，重點介紹培養(yǎng)組學(xué)新技術(shù)在動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀，并展望其未來的發(fā)展趨勢。

【關(guān)鍵詞】培養(yǎng)組學(xué);微生物菌群;動物醫(yī)學(xué)

1培養(yǎng)組學(xué)在反芻動物瘤胃微生物研究中的應(yīng)用

1.1瘤胃微生物純培養(yǎng)技術(shù)

Hungate滾管技術(shù)以及手套厭氧培養(yǎng)箱已廣泛應(yīng)用于厭氧微生物的分離培養(yǎng)。由于不同的微生物對生長環(huán)境和特殊偏好營養(yǎng)物的需求各異，研究者可據(jù)此設(shè)計不同的培養(yǎng)方案對其進行篩選、分離、鑒定、純培養(yǎng)。培養(yǎng)和篩選過程中，可以通過調(diào)整生長環(huán)境參數(shù)（如培養(yǎng)基酸堿度、營養(yǎng)因子等）抑制雜菌生長，從而減少雜菌對目標微生物增殖的影響。主要的操作方法為在厭氧室內(nèi)取部分瘤胃內(nèi)容物樣品，厭氧環(huán)境：50mL·L-1H、200mL·L-1HCO2、750L·L-1H采用0.22μm濾膜過濾后的1×厭氧磷酸鹽緩沖液，以10倍稀釋法將樣品從原液稀釋至10-6濃度。每塊培養(yǎng)基分別接種100μL不同濃度的樣品混合液，在厭氧室內(nèi)39℃培養(yǎng)3d。作為空白對照，每種培養(yǎng)基類型取2個培養(yǎng)基，不進行接種，與其他培養(yǎng)基一起孵育。此外，取適量用于稀釋瘤胃樣品的緩沖液，接種至培養(yǎng)基作參照。上述培養(yǎng)結(jié)束后，取1mL無菌無氧的8.5g·L-1NaCL溶液均勻刮洗平板，用吸管收集該平板上所有的微生物，以備后續(xù)鑒定。以現(xiàn)有的微生物培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)，不斷地改進培養(yǎng)設(shè)備，綜合并優(yōu)化各項培養(yǎng)條件/方式，可以更好地對目標微生物進行體外純培養(yǎng)。

1.2培養(yǎng)基類型、樣品稀釋度和系統(tǒng)發(fā)育與瘤胃微生物可培性的關(guān)系

反芻動物瘤胃微生物群的培養(yǎng)是瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。隨著瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)研究技術(shù)的進一步發(fā)展，反芻動物消化系統(tǒng)微生物功能得以深入研究。計算機科學(xué)與自然生命科學(xué)的交叉融合，使得組學(xué)技術(shù)在詮釋瘤胃微生物的組成功能及代謝特征中作用凸顯，尤其是在瘤胃微生物資源研究中，培養(yǎng)組學(xué)的重要性不言而喻。在瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)研究中找出該系統(tǒng)生境中可被培養(yǎng)的部分以及各種影響其可培性的因素十分重要。采集樣品的稀釋度與實驗過程中使用的各種類型的培養(yǎng)基都會影響瘤胃微生物的可培性，說明在體外重建瘤胃微生物系統(tǒng)仍需要大量細致的培養(yǎng)條件試驗和探索。研究人員通過培養(yǎng)組學(xué)發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物的復(fù)雜性及其功能譜系遠超預(yù)期。因此，通過對瘤胃微生物區(qū)系進行體外重建，以深入了解其生態(tài)/生物功能，對開發(fā)應(yīng)用瘤胃微生物資源具有重要意義。

2培養(yǎng)組學(xué)在人體腸道微生物研究中的應(yīng)用

2.1可培養(yǎng)細菌數(shù)據(jù)庫的增加

近10年，隨著宏基因組學(xué)在微生物研究中的應(yīng)用，人類對腸道微生物區(qū)系的認識似乎已經(jīng)到了平臺期，隨著培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展，腸道中的一些“暗物質(zhì)”逐漸被揭開。一些通過分子手段鑒定不到的“Unclassified”逐漸被培養(yǎng)鑒定，不斷有新培養(yǎng)得到的細菌基因組數(shù)據(jù)被收入人類腸道細菌數(shù)據(jù)庫。據(jù)統(tǒng)計，截至2018年，通過培養(yǎng)方式首次分離得到的菌種已經(jīng)由2015年統(tǒng)計的2172種增加到2776種，所增加的604種細菌中，有372種分離自腸道。研究人員在2012年首次采用培養(yǎng)組學(xué)分離鑒定到174個以前在人類腸道中從未培養(yǎng)過的細菌，并對其中31個新細菌的基因組測序，產(chǎn)生了約1萬個新的未知基因，這不僅擴充了細菌數(shù)據(jù)庫，同時有助于細菌基因功能的深入發(fā)掘。該團隊從2012年到2015年共發(fā)現(xiàn)新種121種，其中有91種是通過培養(yǎng)得到，占比達75%。假設(shè)細菌與最接近它的標準菌株的相似性小于98.65%則被定義為疑似新種，那么使用培養(yǎng)方法每周就能確定1～25個疑似新種。到2017年，該團隊共從人體中分離培養(yǎng)出329個新細菌，使已知的人類細菌庫增加了29%，且首次從人體內(nèi)分離到4種古生菌，其中包括2個新菌種。通過培養(yǎng)組學(xué)增加人類微生物資源庫，有助于研究人員從發(fā)現(xiàn)的新細菌中開發(fā)安全有效的適用于人體的益生菌。可培養(yǎng)參考基因組數(shù)量的增加很大程度依賴于高通量的微生物培養(yǎng)，增加的數(shù)量越多使測序獲得的基因序列與數(shù)據(jù)庫比對的速度越快，同時也提高了對人體腸道微生物基因組的分辨率，進而能更加準確剖析單個菌株的基因功能。可培養(yǎng)基因組參考集的建立，極大的推動了基因組學(xué)在腸道微生物中的應(yīng)用。

2.2與人體腸道細菌療法

相關(guān)菌群的培養(yǎng)結(jié)合宏基因組分析結(jié)果，目前發(fā)現(xiàn)的一些可能涉及到定植、急性或慢性感染的微生物被培養(yǎng)的比例很低。雖然測序能認識到復(fù)雜的腸道微生態(tài)，卻不能明確微生物在宿主中發(fā)揮作用的機制，也無法拿到單菌株做驗證試驗。培養(yǎng)組學(xué)通過培養(yǎng)健康與患病個體腸道中的差異生物標志物，獲得細菌活體樣本，進而深入剖析細菌與疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系機制。腸道微生物區(qū)系的一個主要功能是提供抗定殖能力，其中病原體細菌被抑制或控制在感染水平以下。糞菌移植（FMT）已被廣泛用于治療由于致病或條件致病微生物過多而引起的胃腸道疾病，如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等。這得益于腦腸軸的發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT還被證實可以有效緩解自閉癥[38]。而目前此方法仍存在很多問題，糞便捐獻者在捐贈糞便過程中可能將自身一些潛在致病菌傳染給被移植者，這是治療中很難避免的問題。一些腸道細菌與結(jié)直腸癌或肥胖相關(guān)，據(jù)報道，F(xiàn)MT治療后患者體重指數(shù)無故增加了8.5個點。人們希望確切地知道在治療過程中具體有哪些細菌被轉(zhuǎn)移給了患者。通過培養(yǎng)組學(xué)可以獲得健康人與患者腸道的關(guān)鍵差異細菌群，服用混合菌的方式有效避免了患者受捐贈者帶來的潛在致病菌的影響。

結(jié)束語：

總的來說，除了培養(yǎng)組學(xué)此前的貢獻外，培養(yǎng)組學(xué)以及其他微生物體外純化培養(yǎng)的方法都將促進獸醫(yī)微生物研究領(lǐng)域的擴展進程，這些研究帶來的應(yīng)用價值十分深遠。

參考文獻：

劉鋼，強直性脊柱炎腸道微生物菌群分析及干預(yù)研究.天津市，天津市天津醫(yī)院，2020-12-30.

彭娜，彭先啟，樂敏.微生物菌群培養(yǎng)組學(xué)在動物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2020，51（12）：2942-2953.