不同產地山茱萸中沒食子酸、莫諾苷及馬錢苷成分含量的測定及臨床意義

周瑞靜 田港 陳穎君 郭沅琪 周泓宇 俞薇 單琪媛 鄭平漢

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，具有補益肝腎、澀精固脫的作用［1］。現代藥理研究顯示，山茱萸的主要成分有環烯醚萜類、黃酮、有機酸類等［2-3］，而環烯醚萜類的含量相對較高，其中含量較高的是莫諾苷和馬錢苷，能夠緩解骨性關節炎、調節免疫、緩解神經痛等［4-8］。品種、種植環境及氣候條件等因素均可影響山茱萸藥材有效成分的物質積累差異，進而產生臨床療效和經濟價值的差別［9］。河南、陜西為山茱萸目前最大的產區，浙江臨岐有較豐富的野生山茱萸資源。野生因素、產地、品種對山茱萸成分含量的影響尚無報道。本文采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）指紋圖譜［10］比較不同產地與浙江野生山茱萸不同品種整體特征，并定量分析沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷等三種指標成分，以期為浙產道地藥材山茱萸的野生資源保護、山茱萸優種優育與藥材質量提升提供參考，為臨床藥效保障提供基礎支持。

1 材料與方法

1.1 儀器設備 ACQUITY UPLC H-Class Plus系列超高效液相色譜儀（美國Waters公司），BSA124S電子天平（0.1 mg，sartorius，Germany），SQP電子天平（0.01 mg，sartorius，Germany），KQ-500DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料及試劑 沒食子酸（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-19032801），莫諾苷（樂美天醫藥，德思特生物，批號：DST200303-039），馬錢苷（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-18080704），磷酸、甲醇、乙腈為色譜純，水（超純水，Unique-S*型多功能超純水系統，銳思捷水純化技術有限公司）。山茱萸的采購、產地及批次信息，見表1，并經由浙江中醫藥大學秦路平教授鑒定。

表1 山茱萸的產地及批次信息

1.3 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）。流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序見表2，流速為0.3 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為0.5 μL。混合對照品溶液及山茱萸樣品溶液的色譜圖，見圖1。

圖1 混合對照品溶液（A）及山茱萸供試品溶液（B）的UPLC色譜圖

1.4 混合對照品溶液的制備 精密稱取馬錢苷、莫諾苷、沒食子酸對照品適量，置10 mL容量瓶中，加體積分數為80%甲醇溶解定容，分別制成濃度為30、200、120μg/mL的對照品溶液。

1.5 山茱萸供試品溶液的制備 精密稱取過3號篩的山茱萸粉末0.200 g，置25 mL錐形瓶中，加體積分數80%甲醇溶液定容至刻度，稱重，超聲提取（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，取出，再稱重，補足丟失的質量，取上清液過0.22 μm微孔濾膜作供試液。

1.6 方法學考察 （1）線性關系考察：取對照品溶液，用體積分數為80%的甲醇溶液逐級稀釋，制備7個濃度梯度的混合對照品溶液，按色譜條件進樣測定。（2）精密度試驗：取山茱萸（S4）供試品，按色譜條件連續進樣6次。（3）重復性試驗：取同一批山茱萸（S4）供試品6份，制備供試品溶液，按色譜條件進樣測定。（4）穩定性試驗：取山茱萸供試品溶液，按色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定。（5）加樣回收率試驗：取同一批山茱萸供試品（S7）6份，分別精密加入等量的各對照品，制備供試品溶液，按色譜條件進樣測定。

1.7 樣品含量測定 取12批山茱萸樣品制備山茱萸供試品溶液，按色譜條件進樣測定。

1.8 指紋圖譜的建立 將12個不同產地、批次的山茱萸UPLC圖譜以CDF格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012.130723版本），將S1號批次（浙江省杭州市淳安縣臨岐鎮審豐村2019年采收）譜圖作為對照譜圖，采用中位數法，產生參照圖譜，以多點校正法對各個色譜峰的保留時間進行校正，校正的mark峰選擇沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷3個共有峰。

1.9 聚類分析 相似度計算結果應用SPSS軟件，參數設置為歐式距離，采用ward聚類方法計算。

2 結果

2.1 山茱萸中三種成分線性關系考察結果 三種成分在相應的濃度范圍內與峰面積的線性關系良好，以對照品溶液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制線性方程，見表3。

表3 山茱萸中三種成分線性關系考察結果

2.2 方法學考察的精密度、重復性及穩定性試驗結果 以對照品溶液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制線性方程，精密度試驗計算得到馬錢苷、莫諾苷、沒食子酸峰面積RSD分別為0.90%、1.04%和1.22%，表明儀器精密度良好。重復性試驗計算得到馬錢苷、莫諾苷和沒食子酸峰面積的RSD分別為1.68%、1.54%和2.28%，表明該方法重復性良好。穩定性試驗中，計算得到馬錢苷、莫諾苷和沒食子酸峰面積的RSD分別為1.15%、1.98%和2.92%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3 山茱萸中三種成分加樣回收率試驗結果 分別根據線性方程計算莫諾苷、馬錢苷、沒食子酸在精確稱量的樣品中加入對應標準品后的平均加樣回收率，結果見表4。

表4 山茱萸中三種成分加樣回收率試驗結果

2.4 山茱萸三種成分含量測定結果 根據標準曲線計算12批樣品中三種成分的含量，結果見表5。

表5 山茱萸三種成分含量測定結果（±s）

表5 山茱萸三種成分含量測定結果（±s）

編號 沒食子酸（mg/g） 莫諾苷（mg/g） 馬錢苷（mg/g）S1 0.31±0.01 10.22±0.06 3.11±0.04 S2 0.50±0.00 7.18±0.05 2.61±0.01 S3 0.92±0.02 8.11±0.15 2.65±0.05 S4 1.70±0.03 7.81±0.08 3.46±0.03 S5 0.65±0.01 7.02±0.03 2.35±0.01 S6 0.12±0.01 11.92±0.11 2.27±0.01 S7 0.74±0.00 8.95±0.05 2.17±0.03 S8 0.48±0.01 20.00±0.24 4.90±0.04 S9 1.74±0.01 5.38±0.06 2.37±0.03 S10 1.07±0.00 5.73±0.00 2.48±0.01 S11 0.91±0.02 6.03±0.03 2.45±0.03 S12 1.47±0.01 6.72±0.08 3.09±0.01

2.5 指紋圖譜 見圖2。

圖2 不同產地山茱萸的指紋圖譜

2.6 不同產地山茱萸指紋圖譜相似度分析 結果顯示，在不同產地、批次的山茱萸指紋圖譜之間存在著較高的相似度，但具體相似程度在不同批次之間也存在一些差異，與對照批次相比，S3（淳安瑤山天坪）相似度較高，在0.990以上，S9（杭州臨安）相似度較低，為0.821，其余批次譜圖相似度在0.961～0.986之間。見表6。

表6 不同產地山茱萸指紋圖譜相似度計算結果

2.7 聚類分析結果 見圖3。結果表明，產地、品種、采收時間對于山茱萸指紋圖譜的相似度都有影響。S6、S7、S8三者為一類，對照批次信息可知三個批次產地均為臨岐，且采收時間相近，其中S6、S8兩者更為接近，對照信息兩者都為臨岐蘭林坑采收，而S7為棉花灣采收，說明同一個鎮的不同地理位置對于山茱萸的品質也有影響，原因可能為種植的土壤條件、海拔高度等產生的差異。S2、S5、S3、S1聚為一類，四個批次產地均為淳安縣，說明淳安縣產地的山茱萸的有效成分較為相似。S10、S11、S12、S4聚為一類，這四個批次的產地為河南省和陜西省，說明兩個省份的山茱萸品質較為相近。S9（杭州市臨安區）與其他類別相差較遠，原因可能為臨安產山茱萸的品種不同或是土壤種植條件、氣候等因素與其他地區存在較大的差異。

圖3 不同產地山茱萸聚類分析圖

3 討論

山茱萸的臨床應用廣泛，是治療糖尿病、冠心病以及高血壓的常用藥，中成藥六味地黃丸、金匱腎氣丸及杞菊地黃丸中都用其作配伍，具有收斂固澀、補肝益氣、熄風止痙等功效。現代研究表明，山茱萸主要有免疫調節、降血糖、抗衰老、抗氧化、腎臟保護等作用，其發揮臨床藥理作用的主要是環烯醚萜及其苷、三萜及多糖類、有機酸等［2］。該研究測定山茱萸中沒食子酸、莫諾苷和馬錢苷三種指標成分，也是其主要藥理活性成分，具有較高的臨床藥用價值。

指紋圖譜聚類分析能夠明確區分出浙產山茱萸與其他產區山茱萸藥材，還能區分出野生藥材和栽培品種。浙江省杭州市淳安縣山茱萸總體主要有效成分含量較河南、陜西產區高，其中S1、S2、S3、S5為淳安縣山茱萸栽培品種，S6、S7、S8為臨岐山茱萸野生品種。產地、品種等因素對山茱萸主要藥理指標成分莫諾苷含量影響較大，對馬錢苷、沒食子酸含量影響波動較小。不同產地與品種的山茱萸樣品中，沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷的含量范圍分別在0.1220～1.7373 mg/g，5.3753～19.9978 mg/g，2.1691～4.9048 mg/g。臨岐鎮的山茱萸（石磙棗、正青頭棗）莫諾苷含量較其他產地高，其中以S8野生山茱萸品種石磙棗的莫諾苷含量最高，約為河南、陜西產區栽培品種的2倍，表明臨岐道地產區的野生山茱萸種質資源具有一定質量優勢。S9（杭州市臨安區）和S10（陜西省丹鳳縣）的莫諾苷含量在12批次中較低，可能是產地與品種的不同導致的差異，也可能是因為購買年份較久，有效成分在貯存的過程中發生不同程度的損耗。山茱萸樹種間，品種、產量、果型、果實成熟時間、有效成分含量差異明顯，可結合品種、種植因素等多方面考察、基因轉錄水平的有效成分積累調控，充分利用優質野生品種進行優選優育。

綜上所述，采用UPLC指紋圖譜法同時測定不同產地山茱萸中沒食子酸、莫諾苷和馬錢苷三種成分，方法簡單，操作性和重復性較好，可為山茱萸藥材種質資源保護、優種優育提供科學依據，為臨床藥效保障提供基礎支持。同時，山茱萸所含的有效成分各有其不同的作用，需要進一步分離其有效成分并開展藥理研究，以便更廣泛的應用于臨床。