基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索黃連解毒湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

邢麗穎 白興龍 尚 可 呂小燕

作者單位：1.山西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，太原 030000；2.山西省中醫(yī)院脾胃科，太原 030000

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹瀉、腹痛和黏液膿血便，其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，病變主要限于大腸黏膜與黏膜下層[1]。針對UC 治療，目前臨床多采用糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸類藥物、免疫抑制劑和生物制劑治療，嚴(yán)重者甚至進(jìn)行手術(shù)切除。并且UC 病情的嚴(yán)重程度和高復(fù)發(fā)率[2]給患者及家屬帶來了沉重的心身負(fù)擔(dān)。

黃連解毒湯名見《外臺秘要》，由黃芩、黃連、黃柏、梔子4 味中藥組成。藥理學(xué)研究表示黃連解毒湯不僅有抗菌、抗炎、抗氧化作用，還可以調(diào)節(jié)腸道菌群及免疫功能，同時具有保護(hù)胃腸黏膜作用[3-4]。目前，臨床上很多醫(yī)家用黃連解毒湯治療UC 效果顯著，例如靳瑾和周知然[5]通過研究表明黃連解毒湯可以顯著改善UC 患者的腸道菌群失調(diào)，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對黃連解毒湯治療UC 多成分、多靶點和多通路進(jìn)行挖掘，最后分析其潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 黃連解毒湯有效成分的篩選和靶點預(yù)測

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）分別對黃連解毒湯中黃芩、黃連、黃柏、梔子有效成分進(jìn)行檢索，以口服生物利用度（OB）＞30%和類藥性（DL）＞0.18 為條件，篩選其有效成分及所對應(yīng)的預(yù)測靶點。

1.2 UC 作用靶點檢索

以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞分別檢索GeneCards 與0MIM 數(shù)據(jù)庫，獲取UC 的作用靶點，去除假陽性并去重后，即為UC 的作用靶點。

1.3 “黃連解毒湯-藥物成分-關(guān)鍵作用靶點-UC”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將UC 作用的靶點和黃連解毒湯各藥物有效成分對應(yīng)的靶點一起篩選出共同靶點并制作韋恩圖。將黃連解毒湯中主要有效成分、主要有效成分與治療UC 的關(guān)鍵作用靶點、關(guān)鍵作用靶點與UC 的對應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入到Cytoscape，建立“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將UC 關(guān)鍵作用靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，選擇物種為people，以最低要求互動得分0.9 為篩選參數(shù)，得到黃連解毒湯治療UC 的PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基因本體GO 富集分析與京都基因和基因組百科全書KEGG 通路富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.Gov/）對潛在靶點進(jìn)行GO 功能富集分析，研究黃連解毒湯治療UC 生物功能；KEGG 通路富集分析潛在靶點的相關(guān)通路，研究黃連解毒湯治療UC 的主要信號通路。

2 結(jié)果

2.1 黃連解毒湯有效成分與靶基因

最終得到黃連解毒湯的有效成分共84 個，其中黃芩36 個，黃柏37 個，黃連14 個，梔子15 個。分別得到靶基因黃芩507 個、黃柏510 個、黃連287 個、梔子363 個。

2.2 UC 相關(guān)靶點篩選結(jié)果

最終共篩選出4 622 個UC 相關(guān)基因。將UC 相關(guān)基因與黃連解毒湯靶點基因取交集，共獲得142 個關(guān)鍵靶點基因。見圖1。

圖1 UC 相關(guān)靶點韋恩圖

2.3 “黃連解毒湯-藥物成分-關(guān)鍵作用靶點-UC”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃連解毒湯中主要有效成分、主要有效成分與治療UC 的關(guān)鍵作用靶點、關(guān)鍵作用靶點與UC 的對應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入到Cytoscape，建立“黃連解毒湯-藥物成分-關(guān)鍵作用靶點-UC”網(wǎng)絡(luò)。其中紅色為UC，深藍(lán)色為黃連解毒湯，綠色為黃連解毒湯主要化學(xué)成分，淺藍(lán)色為關(guān)鍵作用靶點。結(jié)果顯示quercetin（槲皮素）、wogonin（漢黃芩素）、kaempferol（山奈素）、beta-sitosterol（β 谷固醇）、coptisine（黃連堿）、Stigmasterol（豆甾醇）等化合物在整個網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用。見圖2。

圖2 “黃連解毒湯-藥物成分-關(guān)鍵作用靶點-UC”網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將142 個共同靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建一共128 個節(jié)點，535 條邊。見圖3。再利用R 軟件計算各基因靶點Degree，同時制作核心靶點柱狀圖，其中排名前6 個靶點分別是JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14。Degree 值分別為35、32、31、30、24、24。見圖4。

圖3 核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值排序

2.5 GO 功能富集分析結(jié)果

運用DAVID 數(shù)據(jù)庫對黃連解毒湯治療UC 的靶點進(jìn)行GO 富集分析，共富集148 個生物學(xué)過程和功能。GO 富集分析分為生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）。BP 主要涉及對脂多糖、無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)及凋亡信號通路、應(yīng)對受傷、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、對外來生物刺激的反應(yīng)、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞死亡的正向調(diào)控等方面。CC 主要涉及膜筏、囊腔、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)等方面。MF 主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶綁定、核受體的活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、血紅素結(jié)合等方面。根據(jù)校正后P值進(jìn)行排序，選擇前20 個進(jìn)行條形圖展示。黃連解毒湯治療UC 主要通過影響機(jī)體DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、信號受體激活劑活性等發(fā)揮作用。見圖5。

圖5 GO 分析結(jié)果柱狀圖

2.6 KEGG 通路富集分析結(jié)果

KEGG 通路富集分析結(jié)果一共得到161 條信號通路，根據(jù)P值排序，列出前20 位條目。通過富集結(jié)果得到黃連解毒湯治療UC 涉及AGE-RAGE 信號通路、乙型病毒性肝炎、IL-17 信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、丙型病毒性肝炎等信號通路。見圖6。

圖6 KEGG 信號通路點狀圖

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，對黃連解毒湯治療UC 的潛在作用機(jī)制進(jìn)行分析，一共得到84 個有效成分，142 個關(guān)鍵作用靶點，共富集148 個生物學(xué)過程和功能、161 條信號通路。

在篩選出的黃連解毒湯84 個有效成分中，槲皮素、山奈素、β 谷固醇、黃連堿、豆甾醇、漢黃芩素等化合物在整個藥物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用。通過現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明槲皮素可有效減少炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β 以及IL-6[6]；同時可以提高腸道有益菌群數(shù)，降低有害菌群數(shù)，改善腸道菌群失調(diào)[7-8]。黃連堿可通過阻斷核因子κB信號通路來釋放炎癥介質(zhì)，達(dá)到抗炎的效果[9]。豆甾醇可以有效減少糞便中的血紅素水平，同時也可緩解腸道組織炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、MCP-1 和環(huán)氧合酶-2（COX-2）的mRNA表達(dá)[10]。漢黃芩素可通過增強(qiáng)Teff 細(xì)胞功能、抑制Treg 細(xì)胞功能來改善腸道炎癥[11]。

依據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，黃連解毒湯治療UC 涉及的關(guān)鍵靶標(biāo)有JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK14。Zhu 等[12]發(fā)現(xiàn)通過對RNF8 介導(dǎo)AKT1 泛素化，進(jìn)而抑制AKT/mTOR 信號通路，最終對UC起一定的保護(hù)作用。并且AKT1 是miR-885-3p 調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的功能性靶基因[13]。miR-145 通過靶向MAPK 來抑制大腸癌中的細(xì)胞增殖[14-15]。IL-6 是一種機(jī)體重要的細(xì)胞因子，通過JAK/STAT3 信號通路發(fā)揮作用，可廣泛參與人體炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡過程及增殖過程。典型的炎癥介質(zhì)IL-6 通過gp130 蛋白發(fā)送信號，gp130 的激活可導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3（STAT3）的激活，由此STAT3進(jìn)入細(xì)胞核并促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括IL-6 水平升高[16]。IL-6 在UC 患者免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮著不可替代的作用[17]。

本研究通過KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯治療UC 的信號通絡(luò)主要與AGE-RAGE 信號通路、乙型病毒性肝炎、IL-17 信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、丙型病毒性肝炎信號通路有關(guān)。RAGE 可誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放，最終參與炎癥反應(yīng)，RAGE 在UC 病變黏膜中呈高表達(dá)[18]。并且國外已有人建議RAGE 啟動子的甲基化和RAGE 啟動子基因型可以共同作為臨床生物標(biāo)志物，以幫助進(jìn)行UC 風(fēng)險評估[19]。IL-17 信號通路的主要因子IL-17有強(qiáng)烈的致炎性，與UC 發(fā)病密切相關(guān)[20]，國外相關(guān)文獻(xiàn)[21]已證明IL-23 對T 細(xì)胞介導(dǎo)的腸炎是不可少的，它主要通過IL-17 與IL-6 促進(jìn)炎癥反應(yīng)。研究證實抗IL-17 治療可以有效緩解腸道炎癥[22-23]。

綜上所述，通過運用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯治療UC 的可能潛在有效成分是槲皮素、黃連堿、豆甾醇、漢黃芩素等，關(guān)鍵基因是AKT1、MAPK1、IL-6 等，通過AGE-RAGE 信號通路、IL-17信號通路等來抑制炎癥，從而起到治療UC 的作用。但本研究仍存在一定的局限性，由于平臺數(shù)據(jù)及有關(guān)軟件功能和算法的限制，為了明確黃連解毒湯治療UC 的復(fù)雜過程和作用機(jī)制，仍需進(jìn)行進(jìn)一步實驗研究加以論證。