鰱魚酶解產物對冷凍面團品質特性的影響

劉 偉，符禹婷，俞 健，王發祥，李向紅，劉永樂*

（長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南省水生資源食品加工工程技術研究中心，湖南 長沙 410114）

冷凍面團技術是指在面制品的生產過程中，運用冷凍技術對半成品進行冷凍處理，將面團制作和熟制流程獨立成兩個環節的面點新工藝[1]。相對傳統的面點加工和銷售方式，冷凍面團相關產品具有成本低、保質期長、便于運輸和冷藏、利于連鎖企業標準化的特點[2]，在中央廚房模式和連鎖經營概念的日益普及的背景下，是我國傳統發酵面制品工業化的必然趨勢。然而，冷凍處理會降低冷凍面團品質，影響熟制后面制品的質量，如酵母活性降低、發酵時間延長、持氣能力減弱、面團強度受損、面包體積減小等[3-5]。關于冷凍損害面團品質的機理，目前普遍認為冰晶的形成導致面團中酵母菌活性降低、面筋網絡結構破壞、水分狀態改變等[5]。目前，添加合適的抗凍保護劑仍是改善面團冷凍損害的最有效途徑，其中應用和研究最多的保護劑主要有復合磷酸鹽、海藻糖、蔗糖酯、黃原膠、抗凍蛋白（肽）等[5-6]。

鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）是我國四大家魚之一，2018年全國養殖量達385.89萬 t，是我國第二大淡水養殖魚類[7]。但鰱魚肉質發面、肌間刺多、土腥味重，不僅食用品質差，而且價格低廉，是最典型的大宗低值淡水魚，目前仍缺乏具有競爭力的深加工途徑[8]。近年來，研究者關注到鰱魚肌肉[8-9]、肌肉蛋白[10]或加工副產物[11]的酶解產物具有優良的抗凍活性，在冷凍魚糜[10-11]、酵母菌細胞[8-9]等的抗凍保護中應用潛力巨大。課題組前期研究發現，在酵母菌懸浮液中添加4 g/100 mL的優選鰱魚酶解產物能將凍融處理后酵母菌存活率由0.71%提高至90%以上[12]，將該酶解產物作為抗凍劑添加至冷凍面團中，能大幅提高冷凍面團（6次凍融循環）的酵母菌存活率和發酵力保存率，緩解醒發時間延長的問題，并能提高面包的比容和感官品質[13]。然而，肌肉或蛋白酶解產物的組成復雜，通常存在還原性肽（抗氧化性）[14-15]，而面團中加入還原性物質對面筋結構的影響一般均為負面[16]，目前還沒有研究鰱魚酶解產物對面團質構特性、面筋形成等特性影響的報道。本研究將以復合蛋白酶酶解鰱魚肌肉不同時間制備的酶解產物添加至冷凍面團中，分析其對冷凍面團焙烤、流變特性及面筋結構等的影響，旨在為以鰱魚酶解產物作為冷凍面團品質改良劑及其定向調控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鰱魚購自湖南長沙當地菜市場，每尾質量為（2.5f0.5）kg；白砂糖、食鹽 長沙市購；高筋面粉克明面業股份有限公司；活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；復合蛋白酶（≥1.5 AU/g） 諾維信（中國）生物技術有限公司；D-(+)-海藻糖二水合物（純度≥98%） 上海笛柏化學品技術有限公司；葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）（100 U/mg）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

BIOTECH-5L生物酶反應器 上海保興生物設備工程有限公司；HMJ-A35M1型和面機 小熊電器股份有限公司；JCD-5型電動壓面機 浙江天喜網絡科技有限公司；YXD-Z204商用箱式電烤爐 廣州市三鼎金屬制品有限公司；TA.XT.Plus型物性測定儀 英國Stable Micro System公司；粉質儀 北京東方孚德技術發展中心；HWS-250B恒溫恒濕箱 天津市泰思特儀器有限公司；TESCAN MIRA3場發射掃描電鏡 捷克TESCAN有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚酶解產物的制備

參考熊思佳等[12]的方法。新鮮鰱魚宰殺取肉，用組織搗碎機攪碎，按固液比1∶5（g/mL）與水混勻后加入酶反應器，加入相當于魚肉（水分質量分數按80%計）干質量3%的復合蛋白酶，在50 ℃、pH 6.5f0.05條件下分別水解15、30、60、120、240 min，90 ℃滅酶15 min，于4 000hg離心15 min后，收集上清液進行冷凍干燥，獲得酶解時間為15、30、60、120、240 min的鰱魚酶解產物（蛋白質質量分數均為85%左右，水分和灰分等含量差異不大，水解度分別9.68%、13.57%、18.42%、23.27%、29.10%[12]），分別命名為SCMH-15、SCMH-30、SCMH-60、SCMH-120、SCMH-240。

1.3.2 冷凍面團的制備

空白組面團配方：面粉100%、去離子水50%、白砂糖5%、食鹽1%、干酵母0.4%；陽性對照組和實驗組面團分別以同樣質量的海藻糖溶液（40 g/L）和鰱魚酶解產物溶液（40 g/L）替代去離子水，相當于抗凍劑的焙烤百分比約為2%。

按配方稱取面粉、白砂糖、食鹽、干酵母，混合均勻置于和面機中，加入水或抗凍劑溶液，自動和面10 min，面團分成若干個30 g的小面團，放入面包模具中壓平，封口膜封口，分別進行0次和4次凍融循環（-18 ℃冷凍18 h，4 ℃解凍6 h為1次凍融循環）后測定相關指標。

1.3.3 醒發時間的測定

面團按1.3.2節的方法凍融處理0次或4次循環，置于恒溫恒濕箱（溫度30 ℃、相對濕度85%）中并開始計時，待面團發酵至最高點觸碰到封口膜時記為發酵終點，所需時間即為面團醒發時間。

1.3.4 面包比容測定

面團按1.3.2節的方法凍融處理0次或4次循環，置于醒發箱中醒發3 h。將烤箱設定為180 ℃，上下火，預熱5 min，將醒發好的面團放入烤箱中焙烤15 min，焙烤結束后將面包從模具中倒出，室溫冷卻30 min。參照GB/T 20981ü2007《面包》，采用菜籽填充劑法測定面包比容。

1.3.5 面團拉伸強度測定

采用質構儀的抗拉測試探頭A/SPR測定。用一個手工面條機將面團制成粗細均勻（直徑約2 mm）的圓柱形面條，固定在探頭夾具上。測試前、中、后速率分別設置為1、3、10 mm/s，距離為90 mm，觸發力5 g。

1.3.6 面團黏附性和延展性測定

面團黏附性：采用質構儀和P/0.5探頭測定，將面團用壓面機壓成厚度為4 mm的面片，鋪在白瓷板上，設置測試前、中、后速率分別為1、0.5、10 mm/s，作用力1 N，返回距離10 mm，接觸時間5 s，觸發力0.049 N，測得曲線的最高點對應的力為面團最大黏附力，能量即曲線所圍成的總面積代表面團黏附性[17]。

面團延展性：采用質構儀的破裂測試裝置HDP/TPB和P/1s探頭測試，將4 mm的面片固定在HDP/TPB夾具上，測試前、中、后速率分別設置為1、1、10 mm/s，距離70 mm，觸發力0.049 N，通過探頭與面片接觸后向下移動，以探頭從接觸面片到面片破裂所運行的距離表示樣品的延展性，最大力表示樣品的韌性[18]。

1.3.7 粉質特性測定

空白組、海藻糖組和SCMH-30組小麥粉分別按1.3.2節加入配方中除水以外的物質混勻，葡萄糖氧化酶組（SCMH-30+GOD）在SCMH-30組的基礎上加入20 mg/kg（以面粉質量計算）GOD；參照GB/T 14614ü2006《小麥粉 面團的物理特性 吸水量和流變學特性的測定 粉質儀法》測定面粉的粉質特性。

1.3.8 掃描電鏡觀察面團顯微結構

參考Xin Chen等[19]的方法稍作修改。將新鮮面團和凍融4次的面團置于-70 ℃超低溫冰箱冷凍12 h，真空冷凍干燥，制得樣品。將凍干的樣品用手從中間掰開，避免面筋結構的機械損傷，噴金后用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結構。

1.4 數據統計與分析

每組實驗進行3個平行，以 fs表示，結果以Origin 2018軟件繪圖；樣本均數以SPSS 25.0軟件進行方差分析，先進行Welch檢驗（α=0.05），方差齊者用Duncan法進行多重比較，方差不齊者用Dunnet-T3分析，結果以小寫字母在圖表中標注，不同字母表示不同處理樣本在相同凍融循環次數時差異顯著（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 鰱魚酶解產物對冷凍面團發酵和焙烤特性的影響

如表1所示，凍融處理前，各組面團的醒發時間在61～67 min之間，面團焙烤后面包比容在2.24～2.38 mL/g之間，均無顯著差異（P＞0.05）。凍融循環處理4次后，各組面團醒發時間均顯著增加，面包比容均顯著降低，可能是因為凍融過程中冰晶的形成和重結晶導致面團中酵母菌、面筋結構的損傷導致其產氣和持氣能力下降所致[20]。空白組面團經4次凍融循環后，醒發時間延長至170 min（增幅為159%），面包比容僅為1.54 mL/g（降幅達34%），而海藻糖組和SCMH-15、SCMH-30、SCMH-60組面團凍融前后醒發時間和面包比容的變化幅度均小于空白組，表明其添加有利于減輕面團的冷凍損害，保持酵母菌活力，抑制面包比容下降；其中，海藻糖組和SCMH-30組醒發時間的延長幅度分別為106%和92%，面包比容減小幅度分別為25%和26%，說明其對面團的抗凍保護效果相對最好。海藻糖有較高的玻璃化轉變溫度，能通過結合水分子減少冰晶生成，已被證實是一種優良的抗凍保護劑[21-22]；課題組前期研究表明，不同鰱魚酶解產物的氨基酸組成和含量差別不大，但隨著水解度增加，其分子質量分布明顯變化、小分子組分含量逐漸增加[23]；其中SCMH-30組60%以上的肽分子質量在1 000～2 000 Da之間[8]，對酵母菌的抗凍保護效果最佳[12]，其能吸附體系中的自由水而限制水分子流動，增加不凍結水含量、抑制冰晶的形成，從而顯著提高了酵母菌凍融過程中的存活率[9]。因此，鰱魚酶解產物也是一種潛在的冷凍面團抗凍劑。

表1 鰱魚酶解產物對冷凍面團醒發時間和面包比容的影響Table 1 Effects of SCMHs on proofing time of frozen dough and bread specific volume

2.2 鰱魚酶解產物對冷凍面團拉伸強度的影響

如圖1所示，凍融前，空白組與海藻糖組面團的拉伸強度差異不大，但所有添加酶解產物的面團的拉伸強度均有所降低，說明添加鰱魚酶解產物一定程度上削弱了面團的拉伸強度，可能是因為酶解產物中的還原性肽影響了面筋蛋白的聚合和二硫鍵的結構狀態，從而降低了面團筋力[24-25]；李向紅等[15]報道水解度10%左右的鰱魚酶解產物抗氧化活性最高，本研究SCMH-15和SCMH-30的水解度分別為9.68%和13.57%，而SCMH-15和SCMH-30組面團的拉伸強度顯著低于其他組（P＜0.05），進一步證實了鰱魚酶解產物中的還原性肽損害了面筋強度的推測。4次凍融循環后，所有處理組面團的拉伸強度均有所降低，說明其面筋網絡結構在凍融過程中受到了破壞[26]；其中空白組降幅超過18%，海藻糖、SCMH-15、SCMH-30組的降幅分別為2%、4%和1%，遠小于空白組，這與其具有較好的抗凍保護活性一致。

圖1 鰱魚酶解產物對冷凍面團拉伸強度的影響Fig.1 Effects of SCMHs on the tensile strength of frozen dough

2.3 鰱魚酶解產物對冷凍面團黏附性的影響

研究過程中發現在相同條件下和面，加入部分鰱魚酶解產物的面團黏度較大，采用質構儀測定相應面片的黏附性，結果如圖2所示。凍融前空白組和海藻糖組面團的黏附性分別為98、97 mNgs，最大黏附力分別為1 408、1 326 mN，無顯著差異（P＞0.05）；但添加了酶解產物后面團黏附性均有一定程度增加，這與和面時觀察到的現象一致，其中SCMH-15和SCMH-30組面團的黏附性分別為171 mNgs和197 mNgs，最大黏附力分別為1 889 mN和1 755 mN，顯著高于空白組和海藻糖組（P＜0.05），也高于其他SCMH組，可能與SCMH-15和SCMH-30的抗氧化活性最高有關[15]。4次凍融循環后，所有組面團的黏附性和最大黏附力均顯著上升，與Lu Lu等[27]報道的結果類似，可能是因為凍融處理損傷了面筋網絡結構和淀粉顆粒，對水分子的束縛性減弱以致水分遷移釋放，從而使面團黏性變大[26,28]。

2.4 鰱魚酶解產物對冷凍面團延展性的影響

面團的延展性是基于質構儀的穿透模式測試，圖3為穿破測試的力-延展曲線圖。凍融前海藻糖組和空白組的曲線高度相似，但全部酶解產物組曲線的力明顯減小，延展距離稍有增加，說明添加酶解產物使面團的韌性（抗延展阻力）減小，影響了面團的延展性，這可能與酶解產物的還原性影響了面筋的筋力有關；其中，SCMH-15和SCMH-30組的力最小，而且力-延展曲線不典型（與空白組相比），主要是因為其面團黏附性大，導致抗延展阻力小且測試過程中穿破非瞬時發生[29]。經過4次凍融循環后，所有面團的延展距離均有所增加，可能與凍融后面團筋力受損有關；其中空白組面團的延展距離增加了約13%，而海藻糖、SCMH-15、SCMH-30組的延展距離分別增加了7%、2%和5%，表明其樣品延展性受凍融循環處理的影響相對較小，這也與其抗凍保護效果的結果基本一致。

2.5 鰱魚酶解產物對冷凍面團結構的影響

綜合上述結果，鰱魚酶解產物中SCMH-30對冷凍面團的抗凍保護效果最好，而對面團黏附性和拉伸強度等影響也相對較大，故選擇SCMH-30組面團觀察其顯微結構在凍融處理前后的差異，結果如圖4所示。凍融前，空白組面團結構均勻，淀粉顆粒密集的深埋在面筋網絡結構中[30]；海藻糖組面團結構與空白組相似，但SCMH-30組面團中淀粉顆粒被面筋包埋的程度明顯較淺，可能是因為SCMH-30中的還原性物質影響了面筋網絡的形成，導致面筋形成較少或部分二硫鍵被破壞，這也是其黏彈和拉伸強度相對較差的主要原因。4次凍融循環后，空白組面團出現了大的孔隙（圓圈所示），許多淀粉顆粒從面筋蛋白中脫離，表明凍融過程中面筋網絡受到了破壞[31]；而且部分淀粉顆粒發生變形（箭頭所示），可能與凍融過程中形成的大冰晶擠壓有關[32]。與空白組相比，海藻糖組面團中也觀察到部分淀粉顆粒變形，但淀粉顆粒基本上均鑲嵌在面筋網絡中；而SCMH-30組面團結構與海藻糖組相似，但淀粉顆粒未觀察到明顯變形，進一步證實了其對冷凍面團的良好抗凍保護效果。

圖4 鰱魚酶解產物對冷凍面團面筋顯微結構的影響Fig.4 Effects of SCMHs on the gluten microstructure of frozen dough

2.6 鰱魚酶解產物對冷凍面團粉質特性的影響

粉質特性反映面粉通過加水在形成面團過程中的流變學特性，對最終面團的品質具有重要的影響[33]。由表2可見，空白組和海藻糖組面粉的吸水率、面團形成和穩定時間、弱化度、粉質指數均無顯著差異，表明添加海藻糖對面粉的粉質特性影響不大；然而，SCMH-30組面粉的吸水率相對空白組降低不顯著（P＞0.05），但面團形成時間、穩定時間、粉質指數均顯著降低，弱化度則顯著上升（P＜0.05），說明SCMH-30的添加明顯改變了面粉的粉質特性，使面團的筋力和彈性下降，影響其加工性能。

表2 鰱魚酶解產物對面粉粉質特性的影響Table 2 Effects of SCMHs on the farinographical properties of wheat flour

此外，相對SCMH-30組，SCMH-30+GOD組面粉的吸水率、粉質指數顯著增加，弱化度則顯著降低（P＜0.05），面團的形成時間和穩定時間也有所增加，說明GOD的添加能明顯改善鰱魚酶解產物對面粉粉質特性的不利影響。GOD是一種常見的面團改良劑[34]，能產生H2O2將面團中的自由巰基氧化成二硫鍵，促進面筋網絡結構形成，從而改善面粉的粉質特性[35]。這也證實了鰱魚酶解產物中的還原性肽可能是改變面團的流變性質的主要因素，而通過添加氧化劑等方式可調控其負面影響。

3 結 論

鰱魚價格低廉，每年養殖產量約400萬 t，是最典型的大宗低值淡水魚，將其酶解后加工成抗凍劑是提升其附加值的重要途經之一。課題組前期研究發現鰱魚酶解產物具有優良的酵母菌抗凍保護活性，是一種潛在的冷凍面團品質改良劑。本研究將系列鰱魚酶解產物作為抗凍劑分別加入冷凍面團中，面團醒發時間、面包比容測定和電鏡觀察結果均證明了其良好的冷凍面團抗凍保護活性，能改善4次凍融循環后面團的發酵性能和焙烤特性。然而，鰱魚酶解產物組分復雜，其含有的某些還原性肽可能會給面團面筋結構的形成和穩定帶來負面影響，從而導致面團黏附性增加、韌性和拉伸強度減小，最終影響冷凍面團及其產品的品質。粉質特性分析表明，添加酶解產物使面粉的吸水率、面團形成和穩定時間、粉質指數顯著降低，弱化度顯著上升，而同時加入GOD能顯著改善面粉的粉質特性，進一步印證了酶解產物的還原性是損害面團流變性質的重要原因，也為后續定向調控酶解產物對冷凍面團的改良作用提供了新思路。