安石榴苷與焦磷酸鈉對肌原纖維蛋白氧化穩定性及凝膠性能的影響

韓馨蕊，李 穎，劉苗苗，范 鑫，馮 莉，曹云剛*

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

肉及肉制品中含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素、礦物質等營養成分，是人體攝入能量和營養的重要來源，深受大眾喜愛[1]。肉蛋白，尤其是肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP），能夠形成熱誘導凝膠，從而賦予肉類制品良好的質地和口感[2]。然而由于宰后肌肉體系中抗氧化系統的崩潰以及鐵離子等過渡金屬離子的存在等，肉蛋白在加工及貯藏過程中極易受到自由基或非自由基攻擊而發生氧化，主要表現為蛋白溶解性和凝膠性等劣變，最終影響肉制品的品質[3-5]。因此有效抑制肉蛋白氧化或提高氧化損傷肉蛋白的凝膠性能具有重要的理論意義與應用價值。

近年來，天然植物源抗氧化劑由于具有來源廣泛、種類多、安全性高等優點，在肉制品中的應用逐漸引起肉品企業和科研工作者的關注。諸如迷迭香提取物[6]、花椒葉提取物[7]和茶多酚等多種天然抗氧化劑已被證明可以在一定程度上抑制蛋白氧化、提高肉品品質。此外，多酚類物質在富含蛋白的體系中還可以通過共價和非共價反應與蛋白的官能團相互作用，從而影響蛋白質的交聯聚集和凝膠性能[8]。安石榴苷是石榴皮中的重要活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎等多種生理功效，在醫療、保健和功能性食品等領域具有良好的應用前景[9]，但安石榴苷作為天然抗氧化劑對肉蛋白氧化穩定性及凝膠性能的影響尚鮮見報道。

多聚磷酸鹽是肉制品加工中應用最廣泛的一種食品改良劑，可以引起活性氨基酸殘基及蛋白質構象發生變化，促進加工過程中MP的凝膠化作用[10]。肉制品加工過程中允許使用的多聚磷酸鹽主要有焦磷酸鈉（sodium pyrophosphate，SPP）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）和六偏磷酸鈉等[11]。SPP是ATP的結構類似物，當適宜濃度（生理水平）Mg2+存在時，PP可以與肌球蛋白頭部S1結合，引起肌動球蛋白解離[10]，在肉制品加工中應用最為廣泛。SPP提高肉制品保水性的作用機制主要包括提高pH值、提高離子強度、螯合金屬離子、解離肌動球蛋白[10]。可見，SPP除具有提高肉制品保水性的功能外，還具有優良的金屬離子螯合能力，因而也具有一定的抗氧化性能[12]。然而目前關于SPP作為抗氧化劑對肉蛋白氧化穩定性的影響以及SPP作為品質改良劑對氧化損傷肉蛋白凝膠性能的影響等鮮有研究，安石榴苷與SPP復配對肉蛋白氧化穩定性和凝膠性能的影響研究尚未見報道。

因此，本實驗以MP為研究對象，在羥自由基氧化體系下探究安石榴苷（自由基清除劑）和SPP（金屬離子螯合劑和保水劑）對MP氨基酸側鏈基團、構象、凝膠行為和凝膠微觀結構的影響，以期為天然抗氧化劑在肉制品中的科學合理應用提供一定的理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長肌購于當地大型超市，置于冰盒運回實驗室，剔除可見脂肪及結締組織，分裝，每袋約100 g，于-18 ℃冷凍貯藏備用。

安石榴苷（純度＞95%，CAS：65995-63-3）成都普思生物科技股份有限公司；水溶性VE（Trolox）、2,4,6-三硝基苯磺酸 美國Ark Pharm公司；哌嗪-1,4-二乙磺酸（piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid，PIPES）、2,4-二硝基苯肼 生工生物工程（上海）股份有限公司；三氯乙酸、石油醚、抗壞血酸、鹽酸胍 天津科密歐化學試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HR/T20M立式冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；PHS-25數顯pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；CM-5分光測色計 柯尼卡-美能達（中國）投資有限公司；UV2900紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TA.XT Plus物性測試儀 英國Stable Micro System公司；Haake mars 60型流變儀 美國賽默飛世爾科技公司；Chirascan-plus 101圓二色光譜儀 英國Applied Photophysics公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器公司；FEI Q45+EDAX Octane Prime型掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；Spectrofluorometer FS5熒光光譜儀 英國愛丁堡公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參照Cao Yungang等[12]的方法：將冷凍貯藏的備用肉流水解凍，切成小塊置于組織搗碎機中，加入4 倍體積的僵直液（含0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L磷酸鈉、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，pH 7.0），低速檔攪拌1 min后離心（4 ℃、1 500hg，15 min）取上清液，重復提取3次，所得沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L NaCl溶液，攪拌均勻并經紗布過濾去除結締組織，調節pH值至6.25，離心，所得沉淀即為MP。采用雙縮脲法測定蛋白質量濃度。

1.3.2 MP的氧化處理

將MP膏用15 mmol/L PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）稀釋至所需質量濃度，分別加入新鮮配置的安石榴苷（記作P）、SPP及二者組合（P+SPP）溶液，攪拌均勻后在4 ℃下于Fenton氧化體系（10 μmol/L FeCl3、100 μmol/L抗壞血酸、3 mmol/L H2O2）氧化12 h，添加Trolox終止氧化反應。最終體系蛋白質量濃度為30 mg/mL，安石榴苷添加量為50 mg/kg，SPP濃度為2 mmol/L（添加0.2 mmol/L MgCl2輔助SPP發揮作用）。同時制備未添加抗氧化劑的未氧化（Control）和氧化（Ox）對照組。

1.3.3 MP的化學和結構變化分析

1.3.3.1 氨基酸側鏈修飾

羰基含量的測定：參照李保玲等[13]的方法，采用2,4-二硝基苯肼法測定蛋白羰基含量，結果以每毫克蛋白所含羰基含量表示，單位nmol/mg。

總巰基含量的測定：參照李穎等[14]的方法，將MP用PIPES緩沖液稀釋至2 mg/mL，用5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）法測定蛋白總巰基含量，結果以每毫克蛋白所含巰基含量表示，單位nmol/mg。

自由氨基含量的測定：參照Benjakul等[15]的方法測定蛋白自由氨基含量，并以L-亮氨酸作標準曲線（y=0.230 7x+0.005 8），樣品中自由氨基含量通過標準曲線計算確定。

1.3.3.2 蛋白的構象變化

二級結構：參照曹云剛[16]的方法通過圓二色光譜儀分析蛋白的二級結構。各組蛋白溶液用PIPES緩沖液稀釋至0.2 mg/mL，掃描范圍為200～260 nm，并扣除溶劑背景。

三級結構：采用熒光光譜儀分析，各組蛋白溶液用PIPES緩沖液稀釋至0.4 mg/mL，激發波長283 nm，發射光譜290～400 nm，激發和發射狹縫寬度均為3.50 nm，同樣扣除溶劑背景[17]。

粒徑測定：采用激光粒度分析儀測定，各組蛋白溶液（2 mg/mL）分散于蒸餾水中，添加樣品時遮光度需達到10%～13%，以避免多次散射。設置MP顆粒折射率為1.570，分散劑折射率為1.330，吸收指數為0.001。

1.3.4 溶解度測定

參照Cao Yungang等[8]的方法，將各組蛋白溶液（30 mg/mL）用PIPES緩沖液稀釋至2 mg/mL，于4 ℃、5 000hg條件下離心15 min，采用雙縮脲法測定上清液中蛋白質量濃度，按式（1）計算蛋白溶解度：

1.3.5 MP的流變學行為表征

參照Li Chunqiang等[18]的方法，將各組蛋白溶液（30 mg/mL）于4 ℃、1 000hg條件下離心1 min去除氣泡。在振蕩模式下平衡3 min后，以1 ℃/min升溫速率由20 ℃加熱至80 ℃，振蕩頻率0.1 Hz，最大應力0.02，結果以彈性模量（G’）為評價指標進行分析。

1.3.6 MP的熱誘導凝膠性能測定

1.3.6.1 熱誘導凝膠制備

稱取約5 g MP溶膠于制膠小瓶中，輕輕振蕩均勻，蓋好木塞，水浴加熱，以1 ℃/min的升溫速率由20 ℃加熱至75 ℃后并保溫10 min，將凝膠取出置于冰水浴冷卻30 min，4 ℃冰箱過夜保存。凝膠性能的測定前蛋白凝膠需從冰箱取出平衡2 h。

1.3.6.2 蒸煮損失和凝膠白度測定

蒸煮損失：將蛋白凝膠與制膠小瓶的瓶壁分離，在濾紙上倒置20 min，待蒸煮汁液完全流盡后稱質量。按式（2）計算蒸煮損失率：

凝膠白度：參照Xia Xiufang等[19]的方法，采用CM-5分光測色計經自檢及零點、白板校正后，測定各組凝膠樣品亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*），并根據式（3）計算凝膠白度：

1.3.6.3 熱誘導凝膠質構測定

參照王耀松等[20]的方法并稍作修改，采用物性測試儀測定各組蛋白凝膠的硬度、內聚性、彈性、咀嚼性、黏聚性。用不銹鋼小鏟輕輕將蛋白凝膠與制膠小瓶分離并取出，置于質構儀平板上進行質構測定。探頭型號P/75，下壓比30%，觸發力10 g，測前速率2 mm/min，測中速率2 mm/min，測后速率50 mm/s。

1.3.6.4 凝膠的微觀結構表征

參照Zhao Yinyun等[21]的方法并稍作修改，用小刀片將蛋白凝膠切成適宜大小，將樣品用體積分數2.5%戊二醛溶液固定4 h后，用pH 7.4磷酸鹽緩沖液清洗3次，然后依次用體積分數50%、70%、90%、95%、100%的乙醇浸泡30 min脫水，樣品經冷凍干燥后噴金，用掃描電子顯微鏡觀察凝膠樣品微觀結構。設置加速電壓15 kV，放大倍數5 000。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均重復2～3次，每次重復3個平行。采用Microsoft Excel軟件進行數據處理，采用Statistix 9軟件進行差異顯著性分析（P＜0.05）和方差分析，采用Sigmaplot 12.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對MP氨基酸側鏈修飾程度的影響

2.1.1 蛋白羰基含量

蛋白質氨基酸側鏈含有許多官能團，容易被氧化產生羰基化衍生物，所以羰基含量可作為評價蛋白氧化程度的重要指標[22]。如表1所示，Control組MP的羰基含量為1.54 nmol/mg，而氧化12 h后Ox組MP的羰基含量迅速升高至3.15 nmol/mg，安石榴苷和SPP的添加能有效抑制氧化導致的蛋白羰基含量上升，抑制效率均達35%，且二者復配效果更好。這可能是由于安石榴苷具有較強自由基清除能力[23]，SPP具有良好的金屬離子螯合能力[24]，二者復配使用時可以更有效地抑制氧化反應。與本研究結果類似，相關研究發現SPP添加能有效抑制蛋白羰基的生成，SPP與兒茶素復合在抑制蛋白羰基生成方面具有協同作用[8]。但值得注意的是，植物多酚對蛋白羰基生成的影響與多酚種類、濃度及實驗條件等有關[12]。

表1 不同處理對MP氨基酸側鏈修飾的影響Table 1 Effects of different treatments on the modification of amino acid side chains of MP nmol/mg

2.1.2 總巰基含量

MP主要由肌球蛋白和肌動蛋白組成，這兩種蛋白中均含有巰基且不含二硫鍵，其中肌球蛋白中巰基含量較高[19]，巰基易遭受羥自由基攻擊形成二硫鍵使蛋白質發生交聯聚合反應。如表1所示，Control組MP的巰基含量為83.75 nmol/mg，而氧化12 h后Ox組MP的巰基含量降低至77.57 nmol/mg，添加安石榴苷和SPP在一定程度上抑制了巰基的損失，但效果并不顯著（P＞0.05）。這可能是由于一方面SPP可以螯合金屬離子降低氧化反應的發生，但另一方面SPP可以促進肌動球蛋白解離、提高MP的溶解度，這提高了羥自由基攻擊MP的幾率[25]；同時安石榴苷作為自由基清除劑可以抑制氧化反應，但是安石榴苷自身被氧化為半醌或醌類物質，后者又可以與蛋白巰基發生加成反應，導致巰基含量降低[26]。因而，本實驗中抗氧化劑對蛋白巰基含量的影響是多種因素綜合作用的結果。

2.1.3 自由氨基含量

蛋白質中賴氨酸側鏈的ε-NH2基團易遭受自由基攻擊，經脫氨基過程生成羰基，后者又可以與NH2發生共價結合，使自由氨基含量進一步降低[2]。如表1所示，Control組MP的自由氨基含量為98.83 nmol/mg，氧化12 h后，Ox組MP自由氨基含量降低至92.69 nmol/mg，降低了6.2%，安石榴苷和SPP的存在減緩了自由氨基含量的降低幅度，這與抑制蛋白羰基含量變化趨勢相似。綜合蛋白羰基、總巰基和自由氨基含量實驗結果可知，安石榴苷和SPP的添加對于抑制氧化誘導的蛋白氨基酸側鏈功能基團修飾具有積極作用，且二者具有一定協同抑制效果。

2.2 不同處理對MP構象的影響

2.2.1 蛋白二級結構變化

如圖1所示，Control組MP的圓二色光譜曲線在222 nm處出現負峰，這是由于MP中肌球蛋白尾部含有大量的α-螺旋結構，Ox組MP在222 nm處峰值降低，說明α-螺旋結構遭到破壞，與此同時形成更多的β-折疊和無規卷曲結構[27]。添加安石榴苷和SPP進一步加劇了α-螺旋結構的損失，這可能是由于安石榴苷結構中含有大量羥基，會影響維持α-螺旋結構穩定氫鍵的穩定性[28]，導致α-螺旋解旋；此外，Kang Juan等[28]研究發現綠原酸與大豆蛋白發生共價結合，導致蛋白α-螺旋結構降低、無規卷曲結構增加。因此安石榴苷氧化產物與MP中氨基酸側鏈基團的共價結合也可能導致α-螺旋降低[29]。SPP的存在可以與肌球蛋白活性部位結合，使肌球蛋白空間結構發生變化，導致α-螺旋結構部分喪失[30]。

圖1 不同處理對MP二級結構的影響Fig.1 Effects of different treatments on the secondary structures of MP

2.2.2 蛋白三級結構變化

蛋白內源性色氨酸熒光特性通常被用于反映蛋白質三級結構的變化[31]。如圖2所示，Control組MP在最大發射波長處熒光強度可達436h104cps，Ox組氧化12 h的MP熒光強度為409h104cps，明顯低于Control組，說明氧化導致MP結構展開。SPP和安石榴苷添加進一步導致MP內源性色氨酸熒光強度降低，這說明SPP和安石榴苷添加促進了氧化條件下MP結構的展開，且安石榴苷的效應更加明顯，這可能與兩種抗氧化劑對MP空間構象的影響有關。

圖2 不同處理對MP內源性色氨酸熒光的影響Fig.2 Effects of different treatments on the intrinsic tryptophan fluorescence spectrum of MP

2.2.3 MP粒徑變化

如圖3所示，與Control組MP相比，氧化應激使MP的平均粒徑增大10.2%（P＜0.05），這是由于氧化導致蛋白結構展開，并促進蛋白發生交聯聚集，導致其分子粒徑增大。安石榴苷添加明顯抑制了氧化導致的MP平均粒徑增大，抑制率達10.50%，其粒徑與Control組相當。添加SPP顯著降低了氧化MP的平均粒徑，較Ox組降低17.65%，這是由于SPP可以解離肌動球蛋白為肌球蛋白和肌動蛋白，降低了MP溶膠體系的平均粒徑[32]。安石榴苷與SPP復配組的粒徑與SPP組基本一致，說明SPP對MP粒徑的影響更大。

圖3 不同處理對MP平均粒徑的影響Fig.3 Effects of different treatments on the mean particle size of MP

2.3 不同處理對MP溶解度的影響

如圖4所示，Control組MP的溶解度為47.53%，Ox組氧化12 h的MP溶解度為39.18%，相比Control組蛋白溶解度顯著降低（P＜0.05）。這是由于氧化導致蛋白結構展開，蛋白質內部疏水基團和巰基暴露，增強了蛋白分子間疏水作用和二硫鍵交聯，引起蛋白聚集，導致其溶解度降低[33]。安石榴苷的存在不能阻止氧化導致的蛋白溶解度降低；而SPP及P+SPP添加均顯著提高了氧化MP的溶解度，較Ox組分別提高了9.78%和20.42%，這主要是由于SPP具有解離肌動球蛋白、提高離子強度等作用[27]。

圖4 不同處理對MP溶解度的影響Fig.4 Effects of different treatments on the solubility of MP

2.4 不同處理對MP流變學性能的影響

如圖5所示，Control組MP在約52 ℃出現峰值，主要是由于肌球蛋白頭部S1的變性和聚集引起[29]。Ox組MP峰值略有上升，且加熱至80 ℃G’明顯升高，說明加熱前氧化誘導的蛋白結構展開促使加熱過程中肌球蛋白頭部-頭部和尾部-尾部之間的相互作用增強[34]。安石榴苷添加對氧化MP的G’曲線基本沒有影響，而SPP添加顯著改變了加熱過程中MP的G’，表現為熱轉變峰徹底消失，整個加熱過程中G’明顯降低，這可能與SPP誘導的肌動球蛋白解離及MP氧化穩定性變化有關[8]。安石榴苷與SPP復配對氧化條件MPG’的影響與SPP單獨添加幾乎一致。Cao Yungang等[12]研究發現綠原酸添加對氧化條件下MP流變特性的影響與其濃度密切相關，低濃度下綠原酸促進了G’的上升，而高濃度則會嚴重破壞MP的凝膠性能。賈娜等[35]研究發現沒食子酸引起MPG’降低，認為這是由于多酚類物質與蛋白形成巰-醌結合物，封鎖了巰基進而抑制蛋白分子間二硫鍵的生成。Cao Yungang等[12]發現SPP添加會顯著改變MP的流變曲線（熱轉變峰消失）但會促進75 ℃時G’的升高。綜上所述，植物多酚及多聚磷酸鹽對氧化條件下MP流變行為的影響可能與多重因素有關。

圖5 不同處理對MP G’的影響Fig.5 Effects of different treatments on the rheological properties (G’) of MP

2.5 不同處理對MP熱誘導凝膠性能的影響

如表2所示，Control組MP的蒸煮損失為12.35%，而氧化12 h后MP的蒸煮損失升高至19.90%。抗氧化劑添加顯著抑制了氧化誘導的凝膠蒸煮損失增大，與Ox組相比，安石榴苷、SPP及其組合處理組的蒸煮損失率分別下降了28.99%、42.56%及54.37%。這可能是由于：一方面，安石榴苷在一定程度上抑制了蛋白氧化，且自身含有多羥基結構，具有很好的親水能力[26]；另一方面，SPP不僅可以抑制氧化誘導的蛋白質氨基酸側鏈修飾，而且可以引起肌動球蛋白解離、提高體系內離子強度，并通過影響分子的靜電荷效應，增強水合作用，使蛋白質網絡結構更加穩定，提高MP的持水性，從而降低蒸煮損失。類似地，葉浪等[36]發現STPP能明顯降低豬MP熱誘導成膠時的蒸煮損失率；Cao Yungang等[12]研究發現在氧化條件下SPP添加降低了MP熱誘導凝膠的蒸煮損失、提高了其凝膠強度。相比Control組，氧化導致MP凝膠白度下降1.96%。SPP的添加對氧化后MP的凝膠白度無顯著改善。添加安石榴苷組使氧化后MP的凝膠白度顯著降低（P＜0.05），這可能是由安石榴苷本身具有的顏色（黃色）所致。

如表2所示，與Control組相比，氧化后蛋白的質構性能變差，表現為硬度、內聚性、彈性、咀嚼性、黏性均降低，其中硬度降低了18.06%。這可能是由于氧化會導致蛋白表面疏水性增強、溶解度降低，使參與成膠的蛋白含量減少[37]，從而導致MP的凝膠強度降低。安石榴苷添加明顯改善了氧化誘導的蛋白凝膠質構性能的劣變，其MP凝膠的內聚性、彈性和咀嚼性恢復至Control組的水平，與Ox組相比，凝膠硬度和黏性分別提高了7.92%和13.92%。而SPP的添加顯著降低了凝膠的硬度、內聚性、彈性、咀嚼性和黏聚性。與本研究結果類似，張典等[38]研究發現SPP和STPP處理降低了肌球蛋白熱誘導凝膠的強度。與之相反，其他研究發現焦磷酸鹽添加提高了肉蛋白的凝膠強度[8,10]。可見多聚磷酸鹽對肉蛋白凝膠性能的影響復雜，受肌肉類型、磷酸鹽種類及濃度、體系離子強度及pH值等多種因素的影響。

表2 不同處理對MP凝膠性能的影響Table 2 Effects of different treatments on the heat-induced gel properties of MP

2.6 不同處理對MP熱誘導凝膠微觀結構特征的影響

如圖5所示，Control組蛋白凝膠呈連續致密的網狀結構，且形狀較規則、分布較均勻。氧化后的MP凝膠微觀結構粗糙疏松、不規則，這是由于氧化導致加熱前MP蛋白間交聯聚集、分子粒徑增大、溶解度降低，致使熱誘導成膠過程中蛋白展開速率低于交聯速率，參與蛋白交聯的活性基團不能有序結合。安石榴苷添加能夠在一定程度上改善氧化誘導造成的凝膠微觀結構。添加SPP可以使蛋白凝膠結構較為均勻、光滑，可能是由于SPP降低了MP平均粒徑、提高了蛋白溶解度。安石榴苷與SPP復合組凝膠的微觀結構更加細膩，這可能與二者復配在抑制蛋白氧化方面具有協同效應有關。

圖6 不同處理對MP熱誘導凝膠微觀結構特征的影響Fig.6 Effects of different treatments on the microstructure characteristics of heat-induced MP gels

3 結 論

安石榴苷、SPP及其組合P+SPP均可以有效抑制羥自由基誘導的蛋白羰基生成和自由氨基含量降低，且安石榴苷與SPP組合效果最好。但這些抗氧化劑添加均無法抑制氧化誘導的巰基含量降低及蛋白結構展開，相反在一定程度上促進了蛋白結構的展開。添加安石榴苷在一定程度上改善了氧化誘導的凝膠質構劣變和蒸煮損失增大。SPP處理降低了蛋白粒徑、提高了其溶解度，顯著改善了凝膠的蒸煮損失，但降低了凝膠的硬度、內聚性、彈性、咀嚼性和黏聚性。因此，安石榴苷和SPP可以在一定程度上抑制蛋白氧化，且對于MP的凝膠性能和持水性能具有顯著調節作用。植物提取物與多聚磷酸鹽復配在肉制品品質改善中具有很好的應用前景，但其在實際肉制品體系中的應用仍有待進一步研究。