熱處理對鱘魚肝臟鐵蛋白穩定性的影響

丁炳文，馬貴紅，李 筱，朱佳倩，李 蝶，馮穎琳，張志清，李樹紅，馬 翼，李美良,*

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625000；2.四川潤兆漁業有限公司，四川 雅安 625000）

鐵蛋白是一種天然的鐵儲存蛋白，廣泛存在于動物、植物及微生物體內，具有維持生物體內的鐵代謝平衡、抗氧化及解毒等功能[1]。典型的鐵蛋白是由24個亞基組成的高度對稱的球狀結構，包括蛋白質外殼和鐵核兩部分，蛋白外殼內外直徑分別約為8 nm和12 nm，鐵核最多可以儲存4 500個鐵原子[2]。傳統的補鐵制劑因其有效性和安全性受到限制，而鐵蛋白卻能以可溶、無毒、生物可利用的形式儲存大量的鐵，因此天然的鐵蛋白是一種良好的鐵補充制劑，并且在補鐵實驗中發現其對人體無毒害作用[3]。

鱘魚是現存淡水魚中體型較大、壽命較長的魚類之一，具有很高的經濟價值和科學研究價值[4]。我國是鱘魚養殖大國，隨著鱘魚養殖規模不斷擴大，鱘魚產品加工量也在迅速增加[5]。然而在鱘魚加工過程中會產生大量的魚骨、魚皮及內臟等下腳料，如果直接丟棄，既污染環境又浪費資源[6]，因而對其進行綜合利用顯得尤為重要。目前關于鱘魚下腳料研究主要集中在魚骨[7-9]、魚皮[10-12]及內臟提取魚油[13]等方面，而對鱘魚肝臟中蛋白的研究及利用較少，如何對鱘魚肝臟中蛋白進行合理的開發和利用亟待研究。此外，由于動物肝臟中鐵蛋白含量較高且儲存較多的鐵[14]，因此對鱘魚肝臟中鐵蛋白進行研究有助于減少資源浪費，并為鱘魚肝臟資源的綜合利用提供參考。同時，熱處理作為食品資源加工利用的重要手段，其可以影響食品資源的應用。有研究表明相較于大多數蛋白質，鐵蛋白具有較高的熱穩定性[2]，鱘魚肝臟鐵蛋白作為本課題組新純化的一種魚類肝臟鐵蛋白尚未確定其熱穩定性。目前國內外關于熱處理對鐵蛋白穩定性方面的研究報道相對較少，主要集中在植物鐵蛋白[15]和部分動物鐵蛋白[16-17]，而關于魚類肝臟鐵蛋白熱穩定性研究鮮有報道。本研究以鱘魚肝臟鐵蛋白（liver ferritin ofAcipenser baerii，ABLF）為研究對象，并探究在不同溫度熱處理對其理化性質的影響，以期進一步豐富鐵蛋白在熱穩定性方面的研究，同時也為選擇合適熱處理條件應用于鱘魚肝臟鐵蛋白制品的加工提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于提取鐵蛋白的西伯利亞鱘魚肝臟購于四川潤兆食品有限公司，于-20 ℃冷凍保存。DE-52弱陰離子交換填料、Sephacryl-S-300凝膠過濾填料 北京瑞達恒輝科技發展有限公司；菲啰嗪-鈉鹽（純度＞97%） 上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸VC（食品級）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍R250 北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為分析純及以上，實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

BioLogic DuoFlow Maximizer 20蛋白純化系統、Dio-Gel-2000凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；TGL 16M高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；MICRO 17微量離心機、Varioskan flash全波長酶標儀、Nicoletl iS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 美國Thermo Scientific公司；HH-601超級恒溫水浴鍋 金壇榮華儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度儀 英國Malvern儀器有限公司；JEM-2000透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本電子株式會社；SPECORD 200 PLUS紫外-可見分光光度計 德國耶拿公司。

1.3 方法

1.3.1 ABLF的分離純化及表征

1.3.1.1 ABLF的分離純化

參考饒承冬[18]的方法并稍作修改。通過65 ℃熱變性、30%～60%硫酸銨溶液分級沉淀、DEAE-52弱陰離子交換層析、Sephacryl-S-300凝膠過濾層析等技術從鱘魚肝臟中分離純化得到ABLF。通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native-polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）測定ABLF的表觀分子質量，電泳條件為8%分離膠4 ℃條件下5 mA運行12 h。通過十二烷基硫酸鈉-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測ABLF的純度及亞基種類，電泳條件為12%分離膠、25 ℃、120 V運行1 h。電泳結束后凝膠均采用考馬斯亮藍染色液R-250染色2 h，并用脫色液進行脫色。采用Bradford法測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標準樣品。鐵蛋白中鐵含量的測定采用Ferrozine法[19]，磷含量測定采用磷鉍鉬藍分光光度法[20]。

1.3.1.2 TEM分析

ABLF的TEM制樣參考Yang Rui[21]和Li Meiliang[22]等的方法并稍作修改。采用磷鎢酸負染色法，使用SEM以80 kV在20 nm比例尺下觀察并拍攝成像。TEM圖片采用Nano Measurer 1.2軟件進行粒徑分析，將圖片導入軟件，設置比例尺后從中隨機選出50個納米粒子，測量每個納米粒子的蛋白殼及鐵核的直徑，并應用SPSS軟件進行數據統計和方差分析[23]。

1.3.2 熱處理對ABLF穩定性的影響

1.3.2.1 熱處理對ABLF溶解度和鐵含量的影響

參考Tang Jiaying等[15]的方法并稍作修改。將純化后的ABLF樣品溶液調整蛋白質量濃度至0.6 mg/mL于25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.25）中，分別取3 mL置于5 支離心管中并編號（0、1、2、3、4），接著將離心管分別置于60、70、80、90、100 ℃恒溫水浴鍋中進行熱處理15 min。冷卻至室溫后，5 000 r/min離心10 min后取上清液，進行SDS-PAGE分析。測定上清液蛋白濃度，透析后測定鐵含量。

1.3.2.2 熱處理對ABLF粒徑穩定性的影響

采用Zetasizer Nano ZS納米粒度儀對經過熱處理后的ABLF溶液進行測定，參考Li Han等[16]的測試方法并稍作修改。具體操作如下：將熱處理后的ABLF樣品上清液過0.45 μm的水系濾膜（減少大顆粒和氣泡的干擾），樣品測定溫度固定在25 ℃，散射光角度固定在90°，測量時間為120 s，進行3次重復測量后取平均值進行分析，粒徑數據導出后采用Origin作圖。

1.3.2.3 FTIR分析

以溴化鉀壓片為空白背景，將凍干樣品與溴化鉀（1∶50，m/m）充分研磨并壓縮成薄片，采用FTIR儀在25 ℃條件下，分辨率4 cm-1，波數范圍4 000～400 cm-1進行掃描32次。參考李萌[24]和暢鵬[25]等的方法，用PeakFit V4.12軟件對酰胺I帶（波數范圍1 600～1 700 cm-1）進行分析。

1.3.3 熱處理溫度對ABLF鐵釋放速率的影響

為探究25～65 ℃條件下溫度對ABLF鐵釋放速率的影響，ABLF釋放動力學的研究參考劉玉茜等[26]的方法并稍作修改。將300 μL相同蛋白濃度1 μmol/L的ABLF溶液分別置于25、35、45、55、65 ℃的水浴條件下15 min，取出后迅速與10 μL的0.1 mol/L菲啰嗪以及10 μL的0.1 mol/L的VC快速混勻后，在波長562 nm處進行測定，觀察吸光度隨時間的變化，每個樣品運行1 500 s，循環時間0.5 s，每個樣品重復測定3次。

1.3.4 ABLF貯藏穩定性分析

將1 μmol/L的鱘魚肝臟鐵蛋白1 mL（緩沖液為25 mmol/L pH 7.25 Tris-HCl），分別置于4 ℃和25 ℃的條件下，靜置數天后，取20 μL不同時間點的ABLF蛋白樣品進行SDS-PAGE以比較其貯藏穩定性。

1.4 統計學分析

數據分析與統計采用SPSS軟件，結果以 fs，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 ABLF的分離純化

2.1.1 DE-52弱陰離子交換柱層析

在本實驗室前期探索最優的條件下，對鱘魚肝臟鐵蛋白粗提液進行DE-52弱陰離子交換層析，層析檢測過程曲線和電泳驗證結果如圖1所示。從圖1A可以看出，層析過程有3個蛋白峰I、II、III。圖1B為層析過程的SDS-PAGE結果，泳道2對應的是65 ℃熱處理和30%～60%硫酸銨溶液沉淀后的粗蛋白提取液，由電泳條帶可知其鐵蛋白含量較多但仍有很多雜蛋白存在。泳道3對應峰I的電泳圖，電泳條帶顯示其含有大量的雜蛋白。泳道4是線性洗脫即峰III對應的電泳結果，其幾乎不含鐵蛋白條帶。泳道1為0.05 mol/L NaCl洗脫峰II的電泳結果，條帶中幾乎不含雜蛋白，因此將峰II對應樣品進行超濾濃縮備用。

圖1 DE-52弱陰離子交換層析（A）及SDS-PAGE結果（B）Fig.1 DE-52 anion exchange chromatogram (A) and SDS-PAGE results (B)

2.1.2 Sephacryl-S-300凝膠過濾層析結果及電泳分析

將上一步超濾濃縮的蛋白液進行凝膠過濾層析，洗脫液為含有0.15 mol/L NaCl的25 mmol/L Tris-HCl pH 7.5的緩沖液，層析實驗結果如圖2所示，只有一個蛋白峰，猜測是目標蛋白峰單體，收集樣品并對其進一步電泳驗證。Native-PAGE顯示ABLF在經過Sephacryl-S-300純化后幾乎被純化至均一程度（圖3A），其表觀相對分子質量約為480 kDa，SDS-PAGE顯示純化后的蛋白達到電泳純，并且ABLF是由2個相對分子質量分別為20.8 kDa的H亞基和20.2 kDa的L亞基構成（圖3B），電泳結果與本實驗室前期的研究結果[18]一致，純化后的ABLF符合后續實驗要求，經計算鱘魚肝臟中ABLF的提取率為30.77 mg/kg。采用Ferrozine法和磷鉍鉬藍分光光度法分別對ABLF的鐵含量和磷含量進行測定，經計算1分子ABLF的含鐵和含磷分別為473.77個和19.68個，相較于哺乳動物，ABLF含有較高的鐵磷比[27]。

圖2 Sephacryl-S-300凝膠過濾層析Fig.2 Sephacryl-S-300 gel filtration chromatogram

圖3 純化后ABLF的Native-PAGE（A）和SDS-PAGE（B）圖Fig.3 Native-PAGE pattern (A) and SDS-PAGE pattern (B) of purified ABLF

2.2 ABLF的納米結構觀察及粒徑表征

典型的鐵蛋白通常分子質量較大（400～550 kDa），故其對應的分子尺寸也相對于多數蛋白質較大，鐵蛋白分子的內徑通常為7～8 nm，外徑12～13 nm，厚度2～2.5 nm[2]。TEM是觀察和分析蛋白質結構相對直接的方法之一，由于鐵蛋白內部的鐵核中含有大量的鐵氧化物晶體因而其呈現出較高的電子密度特征，因此其經磷鎢酸負染色后在TEM下可以觀察到鐵蛋白的基本分子結構特征[28]。從圖4A可以看出，純化所得ABLF是由低電子密度的淺色蛋白外殼和高電子密度的深黑色鐵核組成的球狀分子。采用Nano Measurer 1.2軟件對TEM圖片進行分析，統計結果為ABLF的外徑（12.35f1.22）nm，內徑為（5.82f1.03）nm，與典型的鐵蛋白尺寸大小相符。由圖4B可知，經DLS測定并對測得的峰進行Gauss擬合得到的ABLF粒徑為（14.92f0.03）nm，與TEM結果基本一致。綜上可說明純化所得ABLF具有典型的鐵蛋白分子結構特征和完整的納米球狀結構。

圖4 ABLF的TEM（A）和粒徑分布（B）圖Fig.4 TEM (A) and DLS (B) of ABLF

2.3 熱處理對ABLF穩定性的影響

2.3.1 熱處理后的ABLF樣品圖及SDS-PAGE圖

從圖5A可以看出，60～80 ℃熱處理后的ABLF樣品仍保持較好的穩定性，而經100 ℃熱處理后的ABLF樣品明顯看出底部有棕紅色沉淀。觀察圖5B中各泳道的條帶顏色可知：60～80 ℃熱處理后樣品條帶灰度未有明顯變化，當經90 ℃熱處理后電泳條帶存在由灰度變淺的現象，而100 ℃熱處理后條帶灰度變淺十分明顯。電泳圖條帶灰度深淺常作為蛋白含量變化的參考，因此可以推測溫度升高到一定程度后引起ABLF發生聚集溶解度降低，鐵含量降低。為了驗證這一假設，分別對不同溫度熱處理后的樣品進行蛋白質量濃度和鐵含量測定。

圖5 不同溫度熱處理15 min后的樣品圖（A）及其SDS-PAGE圖（B）Fig.5 Pictures (A) and SDS-PAGE (B) patterns of ABLF treated at different temperatures for 15 min

2.3.2 熱處理對ABLF溶解度和鐵含量影響

鐵蛋白亞基之間存在大量的氫鍵和鹽橋[29]賦予了其較高的熱穩定性能夠耐受較高的溫度（70～80 ℃）不變性。由圖6可知，ABLF樣品的蛋白質量濃度隨熱處理溫度升高整體呈現逐漸下降的趨勢，在60～80 ℃范圍內，蛋白質量濃度下降的速率較慢，表明ABLF的溶解度受此范圍內溫度的影響較小。隨著溫度的進一步升高造成ABLF變性，原本處于分子內部的疏水基團暴露增強，親水基團在表面的分布相對減少，蛋白粒子不能與水相溶失去水膜引起分子間互相碰撞而聚集沉淀，并且經100 ℃熱處理后的ABLF溶解度顯著降低，與圖5中經100 ℃熱處理后的樣品有明顯蛋白沉淀這一結論一致。由圖6可知，經60 ℃和70 ℃熱處理后的ABLF的鐵含量并未有明顯差異，相比之下在80 ℃對ABLF熱處理15 min導致其鐵含量相比于60 ℃熱處理的樣品顯著下降，從（468.55f13.76）μmol/L下降至（349.74f12.36）μmol/L，ABLF的鐵含量損失了約25%。當熱處理的溫度升高至90 ℃，相較于60 ℃熱處理損失的鐵含量占ABLF鐵總量的47%，這可能是較高溫度對ABLF熱處理可能會導致蛋白聚集或結構破壞。與Tang Jiaying等[15]的研究結果一致。

圖6 不同溫度熱處理15 min后的樣品蛋白質量濃度及相應的鐵含量Fig.6 Protein concentrations and iron contents of ABLF treated at different temperatures for 15 min

2.3.3 熱處理對ABLF粒徑的影響

ABLF粒徑隨熱處理溫度的變化情況如圖7所示。DLS結果表明，未經熱處理ABLF粒徑主要集中在12 nm處，表明此時的ABLF單分散性較好；隨著熱處理溫度升高，ABLF在100 nm處增加了一個粒徑分布區域，這表明形成了大的聚集體，12 nm處的粒徑峰向右略微偏移且占總體粒徑分布的比例下降。當熱處理溫度為60 ℃和70 ℃時，ABLF的單分散性受溫度影響較小，這是由于鐵蛋白亞基間存在大量的鹽橋和氫鍵使得其具有良好的熱穩定性。然而隨著溫度進一步升高，ABLF單分散性下降，并且聚集的大分子逐漸增加形成了溶解度較低的蛋白聚集體，這與ABLF樣品圖和溶解度的研究結果一致。在Tang Jiaying[15]和Li Han[16]等的研究中，較高溫度（70～100 ℃）熱處理會導致豌豆種子鐵蛋白和重組牡蠣鐵蛋白形成大尺寸的蛋白聚集體，與本研究所得的結果相吻合。為進一步揭示溫度變化對ABLF影響的原因，對不同溫度熱處理后的樣品進行二級結構分析。

圖7 不同溫度熱處理15 min后的樣品粒徑分布圖Fig.7 Particle size distribution of ABLF treated at different temperatures for 15 min

2.3.4 熱處理對ABLF二級結構的影響

圖8為不同溫度熱處理條件下ABLF的FTIR圖。酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）對蛋白二級結構變化較為敏感，因此通常被用來分析相應蛋白的二級結構變化，此區域圖譜的變化主要是受蛋白結構中C＝O伸縮振動及肽鍵中CüN伸縮振動等影響[30]。FTIR分析采用PeakFit V4.12軟件，依次進行基線矯正、平滑、去卷積、二階導數擬合處理，酰胺I帶中1 646～1 664 cm-1為α-螺旋特征結構、1 637～1 645 cm-1為無規卷曲結構[31]，根據對應的特征峰及峰面積計算二級結構相對含量。

圖8 不同溫度熱處理ABLF的FTIR圖Fig.8 FTIR spectra of ABLF subjected to heat treatment at different temperatures

隨著熱處理溫度的升高，ABLF的α-螺旋結構相對含量逐漸減少，當熱處理溫度升至80 ℃時，ABLF的α-螺旋相對含量由52.1%下降至45.8%，隨著溫度進一步上升，ABLF結構穩定性下降，當溫度升至100 ℃，ABLF中α-螺旋相對含量為30.9%，相較于60 ℃熱處理降低了21.2%，而無規卷曲相對含量整體呈增加的趨勢。Tang Jiaying等[15]報道了60 ℃熱處理后豌豆種子鐵蛋白相較于未經熱處理的樣品二級結構變化不明顯，而經90 ℃和100 ℃熱處理后，其α-螺旋相對含量分別下降至47%和25%，無規卷曲相對含量分別則上升至27%和33%；Li Han等[16]報道了熱處理牡蠣鐵蛋白造成其α-螺旋相對含量降低，當熱處理溫度升高至90 ℃，相較于未經熱處理的牡蠣鐵蛋白α-螺旋相對含量降低了29.8%，二級結構的變化明顯；Yang Rui等[32-33]也報道了一定溫度的熱處理能夠降低大豆種子鐵蛋白和紅豆種子鐵蛋白二級結構中α-螺旋相對含量，以上報道與本研究結果吻合。結果表明，鐵蛋白的變性主要是因為α-螺旋的變化，由于α-螺旋是靠氫鍵維持，熱變性導致α-螺旋中氫鍵斷裂發生解旋，α-螺旋相對含量降低導致鐵蛋白的剛性和彈性結構發生變化（鐵蛋白由24個亞基組成，而亞基主要是由α-螺旋構成[2]），影響整體蛋白的穩定性，因此這很好的解釋了ABLF在經熱處理后溶解度、鐵含量及粒徑的變化。

2.4 熱處理溫度對ABLF鐵釋放速率的影響

已有文獻報道，鐵蛋白鐵還原釋放特性是反應鐵蛋白通道微環境變化的重要指標[34]，為探究溫和條件下溫度對鐵蛋白通道微環境的影響，本研究比較25～65 ℃范圍內對VC誘導的ABLF還原釋放速率和鐵釋放總量的變化，結果如圖9所示。圖9A表明：在同一溫度下，當VC濃度和ABLF濃度保持不變時，吸光度隨時間延長逐漸增加，但隨后在相同時間間隔內，增加程度卻是逐漸降低，推測原因是：VC有較強的還原性，其分子質量較小可以通過ABLF的由親水性殘基組成的三重軸通道進入鐵蛋白內腔（動物鐵蛋白中，三重軸通道由親水殘基構成，四重軸通道由疏水性殘基組成[35]；動物鐵蛋白中三重軸通道控制鐵離子的進出[36-37]，將ABLF鐵核中的Fe3+還原成Fe2+并釋放出來，Fe2+與菲啰嗪反應生成在562 nm處具有紫外吸收的[Fe(ferrozine)3]2+螯合物導致吸光度不斷增加，但隨著時間的延長反應底物——鐵核中的鐵減少，ABLF鐵釋放速率逐漸降低。在相同時間范圍內，隨著溫度的升高（25～65 ℃），吸光度增加程度上升，Fe2+釋放速率逐漸升高（圖9A），并且鐵釋放總量逐漸增加（圖9B）。由此可見，一定溫度范圍內，ABLF的鐵釋放速率與溫度呈正相關，溫度越高鐵釋放速率越快。Yang Rui等[32]報道了在20～60 ℃范圍內，大豆種子鐵蛋白鐵還原釋放初始速率隨溫度上升逐漸升高，而超過70 ℃時初始速率顯著降低（P＜0.05）；胡曉慧等[38]進行溫度和pH值影響魟魚肝鐵蛋白釋放鐵速率的研究，結果表明鐵還原釋放速率在30～45 ℃范圍內隨溫度上升逐漸增加，以上研究結果均與本研究相似。綜合以上分析，在一定溫度范圍內，鐵蛋白軸通道隨著溫度升高而變大，進入鐵蛋白內部的反應物增多，因此ABLF鐵還原釋放速率增加。

圖9 溫度對VC誘導的ABLF還原釋放吸光度變化（A）及其釋放鐵總量的變化（B）Fig.9 Effect of heat treatment temperature on absorbance of ABLF induced by VC (A) and total amount of iron released (B)

2.5 ABLF在不同溫度條件下的貯藏穩定性分析

如圖10A所示，25 ℃貯藏的ABLF在第9天左右電泳條帶相較于前7 d的電泳條帶顏色明顯變淺，這表明ABLF在第9天存在較為明顯的降解。由圖10B可以看出，4 ℃貯藏的ABLF在近2個月后電泳條帶顏色深淺沒有變化即蛋白降解不明顯，這表明ABLF在4 ℃條件下具有良好的貯藏穩定性，因此若將ABLF應用于補鐵制劑領域應將其置于4 ℃冷藏以延長其保質期。Fu Xiaoping等[39]關于大豆種子鐵蛋白（soya bean seed ferritin，SSF）貯藏實驗結果表明切除了EP（extension peptide）肽段的SSF穩定性提高，并且EP-1（H-1亞基）具有明顯的絲氨酸蛋白酶樣活性。Yun Shaojun等[40]報道了蠶豆種子鐵蛋白（broad bean seed ferritin，BBSF）在4 ℃貯藏條件下15 d開始出現明顯降解，Yang Haixia等[41]報道了豌豆種子鐵蛋白在4 ℃貯藏5 d左右亞基出現降解，而在相同實驗條件下，動物鐵蛋白和重組人H鏈鐵蛋白穩定性較植物鐵蛋白好。與天然的SSF和BBSF相比，ABLF在4 ℃的貯藏穩定性大于二者，分析原因是ABLF是動物鐵蛋白不含植物鐵蛋白特有的EP肽段，因此其降解速率相對于具有絲氨酸蛋白酶活性EP肽段的植物鐵蛋白較慢，即其具有良好的貯藏穩定性。

圖10 ABLF分別在25 ℃（A）和4 ℃（B）貯藏條件下的SDS-PAGE穩定性比較Fig.10 Comparison of the stability of ABLF at 25 (A) and 4 ℃ (B) by SDS-PAGE analysis

3 結 論

本實驗通過分離純化制備了電泳純ABLF，并研究熱處理對魚類肝臟鐵蛋白穩定性的影響。研究發現隨著熱處理溫度的升高（60～100 ℃），ABLF溶解度和鐵含量逐漸下降，并且其單分散性下降的同時伴隨著蛋白聚集體的增加。通過FTIR分析，熱處理過程中ABLF二級結構的變化導致了其溶解度、鐵含量和粒徑分布的改變。在升溫過程中，熱變性導致ABLF的α-螺旋中氫鍵斷裂發生解旋，α-螺旋相對含量降低，無規卷曲相對含量增加，蛋白彈性和剛性結構發生改變，導致ABLF發生聚集形成溶解度較低的聚集體，溶解度下降并伴隨鐵含量的下降。而在60～80 ℃時，ABLF受溫度影響變化較小，說明此溫度范圍內ABLF的穩定性相對較高。ABLF的鐵釋放速率在25～65 ℃條件下隨溫度的升高而增加，分析與其他鐵蛋白[32,38]一樣，ABLF的軸通道在較為溫和的條件下隨溫度升高而增大。此外，ABLF在4 ℃條件下的貯藏穩定性大于25 ℃，主要原因是其不含具有絲氨酸蛋白酶活性EP肽段，因而其貯藏穩定性高于植物鐵蛋白[39-41]。本研究豐富了熱處理對鐵蛋白穩定性的研究，研究結果表明熱處理溫度導致ABLF二級結構發生改變是影響其穩定性的重要原因。由此可見，在選擇熱處理條件應用于ABLF加工時，溫度應盡量控制在80 ℃及以下，可以保持其穩定性。以上發現將有利于鱘魚肝臟資源的綜合利用及鐵蛋白在食品加工領域的應用。