基于轉錄組揭示底酸促進巴氏醋桿菌產酸的分子機制

李 甜，葛正凱，陳 宇，蘇聰燕，徐曉裕，史學偉，王 斌*

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832001）

醋酸菌是一類能將乙醇轉化為醋酸的專性好氧革蘭氏陰性菌，廣泛分布于含糖和含乙醇的酸性環境中，是釀造食醋的主要菌種[1]。醋酸發酵過程中，醋酸菌在乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）的催化下將乙醇氧化為乙醛，進一步在乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的催化作用下將乙醛氧化為乙酸，積累大量醋酸[2]。到目前為止，醋酸菌已被鑒定出19個屬和92個種，其中，用于釀造食醋的醋酸菌主要來自醋酸桿菌屬和駒形桿菌屬[3]。醋酸桿菌主要用于釀造酸度較低的米醋和果醋，而駒形桿菌則用于釀造酸度較高的酒精醋[3-4]。巴氏醋桿菌是我國醋制品釀造過程中的主要微生物之一，尤其是巴氏醋桿菌CICC 20001廣泛應用于食醋和各類果醋飲料發酵，如葡萄醋、山楂醋和荔枝蜜醋等[5-7]。

醋酸是一種高效的抗菌化合物，可防止發酵食品中腐敗性和致病性微生物的生長[8]。當細胞中醋酸的體積分數達到0.5%時會產生細胞毒性，破壞細胞膜的生理功能，不利于菌株的生長及代謝活動，而醋酸菌則能生產和耐受較高濃度醋酸，表現出較強的耐酸特性[9]。醋酸菌耐酸分子機制成為醋酸菌代謝研究熱點之一。研究表明，醋酸菌能通過細胞膜保護機制[10]、醋酸同化[11]，ABC轉運蛋白系統[12]和分子伴侶[13]等途徑抵抗醋酸對醋酸菌的毒害性作用。原核生物對酸變化的應答體現在從基因水平到表型水平的多個層次上，而轉錄水平是其中關鍵的一環。轉錄組是不同類型細胞或組織在不同條件下所包含的不同基因表達譜，即全部轉錄本的序列信息[14]。目前，轉錄組學已廣泛應用于全面探究生物體的復雜生命活動。Sakurai等[15-16]采用轉錄組學方法探討了醋酸菌在不同碳源和含乙醇培養基上生長過程中基因表達譜的變化。Xia Kai等[17]利用轉錄組學方法研究了巴氏醋桿菌Ab3在高酸脅迫下的響應機制。

盡管醋酸菌能生產醋酸，發酵過程中產生的醋酸對醋酸菌仍會產生一定毒性，導致醋酸菌的生長和產酸效率低下。因此，實現醋酸菌細胞適應度與醋酸合成之間的平衡是提高醋酸產率的關鍵挑戰。食醋發酵過程中，添加一定量底物醋酸能提高醋酸菌產酸速率，縮減生產成本[18]。研究表明添加0.5%底物醋酸能提高巴氏醋桿菌產酸效率，但底物醋酸促進巴氏醋桿菌產酸的分子機制仍不清晰[19]。本實驗選擇體積分數0.5%底物醋酸并采用轉錄組學方法，通過篩選差異表達基因和代謝通路分析，探討添加底物醋酸促進巴氏醋桿菌產酸的分子機制，旨在為提高醋酸菌發酵產酸速度提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

所用菌株為巴氏醋桿菌CICC 20001，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養基與試劑

GYPE培養基：1 g/L葡萄糖、2 g/L蛋白胨、5 g/L酵母浸粉、6%無水乙醇；GYPA培養基：1 g/L葡萄糖、2 g/L蛋白胨、5 g/L酵母浸粉、6%無水乙醇、0.5%無水乙酸。pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉 天津盛奧化學試劑有限公司；無水乙醇、無水乙酸 天津風船化學試劑科技有限公司；RNAprep Pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒、TIANGEN?試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Ribo-zeroTM試劑盒 美國Epicentre公司。

1.2 儀器與設備

XFH-50CA全自動高壓滅菌鍋 浙江新豐醫療器械有限公司；BCM-1000/1300/1600A超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；BSD-YX3400立式雙層智能精密型搖床 杭州俊升科學器材有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機、Nanodrop 2000C核酸蛋白檢測儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；UV-1750型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；2100生物分析儀 安捷倫科技（中國）有限公司；GeI Doc XR+凝膠成像系統 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

將保藏在甘油管中的菌株接種在100 mL GYPA培養基中進行活化。當培養液發酵到達對數期（OD660nm＞0.5）時，取5 mL培養液接種至100 mL新鮮的GYPA培養基中。當新轉接的GYPA培養基發酵達到對數期時，將培養液倒入50 mL離心管中，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，去除上清液，并加入50 mL GYPE培養基構成種子液。此實驗培養液均在170 r/min、30 ℃搖床中培養，實驗中所用的無水乙醇及無水乙酸均用0.22 μm有機濾膜進行過濾處理。

1.3.2 添加底物醋酸啟動醋酸發酵生長曲線和產酸曲線的測定

向100 mL的GYPE培養基中分別加入不同體積分數（0%和0.5%）醋酸溶液，取5 mL種子液于上述培養基中進行發酵，每隔24 h取樣。在波長660 nm處測定體積分數0%和0.5%底物醋酸溶液發酵時的吸光度。以OD660nm為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制醋酸發酵生長曲線，觀察其生長情況。用5 g/L的酚酞作指示劑，0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液進行滴定至微粉色并且30 s后不變色即為滴定終點量。以醋酸的凈增加量為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制不同底酸啟動醋酸發酵的產酸曲線，觀察各個培養物之間的產酸情況。產酸量[19]按下式計算：

式中：V0為未發酵樣液消耗的氫氧化鈉溶液體積/mL；V1為發酵樣液消耗的氫氧化鈉溶液體積/mL；V2為取樣體積/mL；C為氫氧化鈉溶液的濃度/（mol/L）；60為醋酸的摩爾質量/（g/mol）。

1.3.3 轉錄組分析

1.3.3.1 RNA樣品的制備

從種子液中取5 mL培養液分別加入GYPE和GYPA培養基中進行發酵。以不加醋酸的發酵為對照組，以添加0.5%底物醋酸的發酵為實驗組，分別在巴氏醋桿菌發酵早期（1 d）和中后期（7 d）4個點進行取樣，每個樣品設置3次平行。將發酵液倒入50 mL離心管中，4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，迅速放入液氮中速凍，之后轉移至-80 ℃保存備用。

1.3.3.2 RNA的提取，文庫建立及轉錄測序

采用Trizol法提取醋酸菌細胞中的總RNA[20]。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性以及是否有gDNA的污染，使用核酸蛋白檢測儀檢測RNA的純度（OD260/280=1.8～2.2），以及生物分析儀精確檢測RNA的完整性（Rin＞6.5）。質量合格的RNA樣品用于文庫構建，通過Ribo-zeroTM試劑盒去除rRNA，并將mRNA片段化，以mRNA為模板，添加dNTP將其反轉錄成cDNA。雙鏈cDNA先進行末端修復、加A尾和接頭，再進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，并純化PCR產物，得到最終的文庫。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后進行Illumina HiSeqTM2500測序。高通量測序得到的樣本轉錄組數據經過CASAVA堿基識別分析轉化為原始序列Raw reads。對Raw reads進行過濾，除去里面含有接頭的Reads、去除N的比例大于10%的Reads和除去低質量的Reads后，獲得Clean reads，以保證信息分析質量。從基因組網站直接下載A.pasteurianusIFO 3283-01的參考基因組和基因模型標注文件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_013209.1?report=fasta）。使用Bowtie 2建立參照基因組指數和將Clean reads與參照基因組比對，獲取其在參考基因組上的位置信息。

1.3.3.3 基因差異表達分析和富集分析

采用HTSeq對各樣品進行基因表達水平分析，根據每百萬碎片中來自某一基因每千堿基的轉錄本所包含的碎片數目（fragments per kilobase million，FPKM）計算每個基因的表達水平[21]。考察添加0%和0.5%底物醋酸時發酵早期（Z2 vs Z1；Z2為加0.5%底物醋酸發酵1 d，Z1為不加醋酸發酵1 d）和發酵中后期（F2 vs F1；F2為加0.5%底物醋酸發酵7 d，F1為不加醋酸發酵7 d）的差異表達基因。利用edgeR對結果進行差異表達分析并獲得差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）[22]。選擇顯著DEGs的標準如下：1）|log2Fold Change|＞1.0，2）統計學顯著性水平P＜0.05；使用SPSS 25.0進行顯著性分析。通過基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析（http://www.geneontology.org）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析（http://www.genome.jp/kegg/）獲得基因注釋列表。

2 結果與分析

2.1 添加底物醋酸對巴氏醋桿菌發酵的影響

本課題組前期研究表明，加入一定濃度的底物醋酸能夠促進醋酸發酵，但底酸促進醋酸發酵的分子機理尚不明確[19]。本實驗以不添加底物醋酸為空白對照，考察添加0.5%底物醋酸對巴氏醋桿菌CICC 20001發酵過程中菌體生長和產酸的影響。

由圖1可知，巴氏醋桿菌CICC 20001的生長量與發酵時間呈正相關，并且0.5%底物醋酸添加量下的生長量高于不加醋酸的對照組。添加0.5%底物醋酸時，巴氏醋桿菌CICC 20001的產酸量明顯高于空白對照，增加的趨勢具有顯著性。由此可見，添加合適體積分數醋酸可以促進巴氏醋桿菌CICC 20001的發酵，但是底酸的添加量與醋酸的產量并不呈正相關[23]。選擇發酵第1天（發酵早期）和第7天（發酵中后期）取樣以獲取轉錄組樣品。

圖1 添加底酸對巴氏醋桿菌CICC 20001生長和產酸的影響Fig.1 Effect of exogenous acid addition on the growth and acid production of A.pasteurianus CICC 20001

2.2 轉錄組測序數據的質控

轉錄組測序得到的原始序列會存在低質量的reads，需要對原始數據進行質量控制，以保證后續分析的質量。由表1可知，樣本間基因組的GC質量分數均在55%左右，錯誤率均不大于0.02%，測序質量分值Q30均在90%以上，說明測序原始數據結果可靠，可進行后續生物信息學分析。

表1 巴氏醋桿菌CICC 20001轉錄組測序數據統計Table 1 Statistical analysis of transcriptome sequencing data of A.pasteurianus CICC 20001

2.3 醋酸發酵過程中DEGs分析

通過DEGs的篩選有助于發現基因的功能，更有助于揭示某些現象的分子機制。添加底物醋酸啟動醋酸發酵早期（Z2 vs Z1）表達出的基因共有2 247個，其中顯著性的DEGs有412個，包括394個上調基因和18個下調基因；而在中后期（F2 vs F1）共檢測出2 240個基因，其中顯著性差異表達的基因有70個，包括30個上調基因和40個下調基因（圖2A）。在醋酸發酵早期和中后期表達的總基因數量無明顯差異，而顯著DEGs數量差異較大。由圖2B可知，有36個顯著DEGs在醋酸發酵中共表達，有376個顯著DEGs只在醋酸發酵早期表達，34個顯著DEGs只在醋酸發酵中后期表達。轉錄組數據表明，在巴氏醋桿菌CICC 20001發酵早期，顯著上調的基因多于下調的基因數目，而在巴氏醋桿菌CICC 20001發酵的中后期，顯著下調的基因略多于上調基因數目。這些在發酵早期上調的基因和中后期顯著差異表達的基因可能是潛在的促進巴氏醋桿菌CICC 20001產酸的關鍵基因。同時在加入低添加量醋酸后，與醋酸發酵中后期相比，在發酵早期細胞內基因的表達變化較為明顯，說明底物醋酸可能在醋酸發酵早期發揮更重要的作用。

圖2 添加底酸促進巴氏醋桿菌CICC 20001發酵過程中DEGs表達情況Fig.2 Differential gene expression induced by exogenous acetic acid during fermentation of acetic acid by A.pasteurianus CICC 20001

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

2.4.1 醋酸發酵早期的DEGs富集分析

隨著我國刨花板行業不斷淘汰部分落后產能，新增先進生產線，質量不斷提高，產量也有增加，刨花板出口出現增長。今年前3季度累計，我國刨花板出口量完成17.4萬t，比上年同期增長18.29%。出口金額同比增加9.74%，主要出口到蒙古、印度和我國臺灣省等。

GO是描述基因功能的綜合性數據庫，GO數據庫把基因的本體分為3類，即生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。將412個DEGs與GO數據庫進行比對，得到256個GO條目。根據P-value分別在BP、CC、MF中篩選部分GO條目進行分析，如圖3所示。

圖3 添加底酸促進巴氏醋桿菌CICC 20001醋酸發酵的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of DEGs induced by exogenous acetic acid in acetic acid fermentation by A.pasteurianus CICC 20001

由圖3可知，在醋酸發酵早期的DEGs顯著富集在BP過程的運輸、定位、建立定位和跨膜運輸；CC過程的細胞膜；MF過程的轉運活性、ATP酶活性、水解酶活性和陽離子活性等功能。結果表明，DEGs主要與醋酸發酵的跨膜運輸過程、細胞膜、轉運活性和酶活性等有關，說明低濃度底酸處理可能會影響巴氏醋桿菌的物質轉運及相關酶的活性。

KEGG是整合了基因組、化學和系統功能信息的綜合性數據庫。為了進一步了解基因的生物學功能，通過KEGG數據庫對細胞內DEGs進行功能分析。醋酸發酵早期階段的DEGs共涉及42 條通路，根據P-value篩選出前20 條通路進行分析。如圖4所示，圓圈代表注釋到KEGG通路上的基因數目，顏色從藍到紅代表富集的顯著性大小（以-lg（P-value）計算）。發現顯著富集的幾個被注釋的信號通路為煙酸和煙酰胺代謝、ATP結合盒式轉運蛋白（ATP-binding cassette，ABC）轉運蛋白、雙組分體系（two-component systems，TCSs）、精氨酸生物合成、丙酸代謝等。研究發現，低體積分數底酸對醋酸發酵早期的輔因子和維生素代謝、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜運輸以及信號轉導等通路均有影響。因此，推測與跨膜運輸相關的DEGs可能在醋酸發酵早期的代謝機制中起重要調節作用。

圖4 添加底酸促進巴氏醋桿菌CICC 20001醋酸發酵的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of DEGs induced by exogenous acetic acid in acetic acid fermentation by A.pasteurianus CICC 20001

2.4.2 醋酸發酵中后期的DEGs富集分析

對醋酸發酵中后期的70個DEGs進行GO富集分析得到21個GO條目，根據P-value分別在BP、CC、MF中篩選部分GO條目進行分析。如圖3所示，這些DEGs主要富集在BP過程的氧化還原過程和調控過程；CC過程的細胞膜、細胞膜的整體組成、細胞膜的固有組成以及細胞膜組件；MF過程的氧化還原酶活性、金屬離子結合和陽離子結合等功能。結果表明醋酸發酵中后期階段的DEGs主要與細胞的調控過程、細胞膜和氧化還原活性等有關，進而在此階段可能會對巴氏醋桿菌的生長代謝進程造成影響。

對醋酸發酵中后期的DEGs進行KEGG通路分析，共涉及21 條通路。如圖4所示，數量較多的幾個被注釋的信號通路為煙酸和煙酰胺代謝、硫代謝和TCSs等。研究發現，低添加量底酸對醋酸發酵中后期的輔因子和維生素代謝、能量代謝和信號轉導等均有影響。因此，推測與物質代謝和能量代謝相關的DEGs可能在醋酸發酵中后期發揮一定的作用。

2.5 底酸促進巴氏醋桿菌醋酸發酵的分子機理

通過GO富集分析和KEGG通路分析，發現ABC轉運蛋白、尿素代謝、TCSs、丙酸代謝和能量代謝等途徑對醋酸發酵過程影響較大，并從以上通路中找出重要基因如表2所示。

表2 巴氏醋桿菌CICC 20001醋酸發酵過程中的DEGsTable 2 DEGs induced by exogenous acetic acid in acetic acidfermentation by A.pasteurianus CICC 20001

2.5.1 ABC轉運蛋白

營養物質只有進入了微生物細胞之后才能被微生物細胞內的新陳代謝系統分解利用，進而使微生物正常生長繁殖。細菌可以通過特殊的轉運機制（包括外膜受體和孔蛋白以及內膜中的高度特異性轉運蛋白）獲取必需的營養物質[24]。ABC轉運蛋白是一大類跨膜運輸蛋白的統稱，廣泛存在于生物體中，它利用ATP水解產生的能量通過細胞膜轉運底物，包括氨基酸、離子、糖類、脂質和弱酸等[25-26]。此外，Na+/H+反向轉運蛋白可通過將H+逆向轉運出細胞外來抵制細胞中過高的H+濃度，可提高微生物的耐酸性[27]。生物體可通過跨膜運輸抵御對自身不利的細胞內外環境變化，以維持正常的生命活動。在研究中發現醋酸發酵早期，細胞中脂肪族磺酸鹽ABC轉運蛋白底物結合蛋白基因（APA01_RS06900、APA01_RS06905）、pstS、urtABCDE和cydCD等上調（表2、圖5）。脂肪族磺酸鹽ABC轉運蛋白底物結合蛋白基因、pstS和urtABCDE分別與細胞中硫、磷酸和氨基酸等營養物質的轉運有關[28-29]。cydCD在ABC轉運蛋白中具有重要作用，它們能夠與調節ATP酶活性的血紅素輔助因子結合，并且與細菌的代謝、跨膜運輸、氧化還原反應和耐受性等密切相關[30-31]。與不加底酸的對照組相比，這些上調的基因說明在酸脅迫下的巴氏醋桿菌CICC 20001可能通過加快對細胞外營養物質的吸收、促進大量能量的生成和提高酶活滿足自身的生長和代謝需要，以促進巴氏醋桿菌CICC 20001的產酸。

微生物可通過產生堿性化合物抵抗酸性環境。目前已知尿素和精氨酸這2種主要底物能夠產生堿性物質。精氨酸代謝可產生尿素，而尿素產生氨的途徑有2種，一是在脲酶的調控下迅速水解為氨和二氧化碳；二是在尿素羧化酶和脲基甲酸水解酶作用下水解為氨和二氧化碳[32-33]。其中氨分子在細胞中起質子消耗作用，因而脲酶、尿素羧化酶和脲基甲酸水解酶在獲取堿中起著重要作用。產堿機制對細菌在不同酸性條件下的生存有效，有研究表明由ureIABCEFGD操縱子組成的脲酶系統可以保護一些細菌，如羅伊氏乳桿菌和幽門螺旋桿菌免受酸引起的損害[34-35]。在醋酸發酵早期urtABCDE、尿素羧化酶基因（APA01_RS07060）、atzF以及與脲酶系統相關的脲酶亞基β基因（APA01_RS11920）、脲酶亞基γ基因（APA01_RS11925）和ureC等上調（表2、圖5），說明這些基因可能調控細胞中脲酶分解尿素產生氨，而氨可能參與了細胞中醋酸的中和，進而減弱了細胞中醋酸的積累，促進巴氏醋桿菌CICC 20001產酸。

2.5.3 TCSs

TCSs是由感應組氨酸激酶和反應調節蛋白組成的一種細胞應答反應，也是存在于細菌內的一種信號轉導體系。通過這個系統可監測外界環境的壓力，并調控基因表達來適應環境脅迫，是細菌適應外界壓力的一種自我保護機制[36]。有研究表明，TCSs體系在細菌的酸脅迫中發揮了重要的作用。Li Yuanjing等[37]發現酸脅迫環境激活了Komagataeibacter hanseniiHDM1-3的TCSs信號通路，調控了其脂肪酸的合成，進而誘導下游脂肪酸組成和結構的變化，從而幫助細菌抵抗酸性環境。Choi等[38]發現TCSs中的PhoQ/PhoP體系在酸性環境下被激活，刺激靶基因的轉錄。有研究表明雙組分傳感器組氨酸激酶和PstS與細菌中磷水平調控密切相關[29]。在本研究中發現醋酸發酵早期，與TCSs有關的雙組分傳感器組氨酸激酶基因（APA01_RS01605）和pstS等多個基因顯著上調（表2、圖5），表明TCSs可能受到酸性環境的激活。同時，雙組分傳感器組氨酸激酶基因和pstS的表達量增加，說明在醋酸發酵早期，巴氏醋桿菌CICC 20001可能通過提高磷的吸收和利用，保持酸性條件下細胞膜的完整性和流動性，以抵抗細胞所面臨的酸性環境，促進巴氏醋桿菌CICC 20001代謝產酸。在巴氏醋桿菌CICC 20001發酵中后期，TCSs中有2個DEGs上調（APA01_RS10925、APA01_RS10920）（圖5），表明TCSs在高醋酸環境中仍然發揮著重要作用，維持細胞正常生命活動，但是其積極作用略低于醋酸發酵早期，也進一步表明低濃度底酸可能主要在醋酸發酵早期激活TCSs以促進巴氏醋桿菌CICC 20001產酸。

2.5.4 醋酸同化及丙酸代謝

醋酸同化被認為是醋酸菌耐酸機制之一。醋酸進入細胞后，可由醋酸菌中特殊的ABC轉運蛋白AatA將醋酸排出細胞外；也可在醋酸激酶、磷酸轉移酶和乙酰輔酶A合酶的作用下將醋酸轉化為乙酰輔酶A，并通過三羧酸循環進行同化，這一過程不僅能為醋酸發酵提供能量，也可減少細胞中醋酸含量，減弱醋酸對細胞的毒害作用[20]。在醋酸發酵早期，與醋酸同化相關的ackA、pta和acs等基因明顯上調（表2、圖5），表明在加入0.5%底物醋酸后，細胞中可能出現了醋酸同化現象，減輕巴氏醋桿菌所面對的酸性環境。丙酸是自然界中一種豐富的分解代謝產物，是生物體生長代謝的潛在碳源。但是，丙酸的積累對細胞也具有一定毒性，因此丙酸分解代謝也可以視為一種解毒機制。丙酸可在丙酰輔酶A合成酶或醋酸激酶和磷酸轉移酶的催化下轉化為丙酰輔酶A，再經過2-甲基檸檬酸循環生成琥珀酸，進一步進入丙酮酸代謝，丙酸代謝下的2-甲基檸檬酸循環是一種新的潛在耐酸機制[20,39]。在醋酸發酵早期，編碼丙酸代謝關鍵酶甲基異檸檬酸裂解酶的基因prpB明顯上調，將異檸檬酸甲酯轉化為琥珀酸進入丙酮酸代謝，進而將丙酸分解，可能減弱細胞中的酸性環境，改善了巴氏醋桿菌的生長代謝，促進其產酸。但丙酸在醋酸發酵過程中的產生機制還有待進一步研究。另外，研究表明與酸同化相關的基因ackA、pta、acs和prpB在發酵過程中一直處于上調水平（表2、圖5），其可能減弱了醋酸所產生的酸性環境對巴氏醋桿菌生長帶來的脅迫影響，對底酸促進巴氏醋桿菌產酸發揮了重要作用。

2.5.5 能量代謝

能量代謝是一切生物代謝的核心問題。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）這2種輔酶是生物體氧化還原反應中產能所必需的，也是電子傳遞鏈上的遞氫載體，還是參與非氧化還原信號通路的酶的底物，從而調節生物學功能，包括物質代謝、能量代謝、DNA修復和脅迫抗性等[40]。在醋酸發酵早期，研究發現nadA、nadC、nuoF和cydB等上調（表2、圖5）。其中，NadA與NadC參與NAD+的從頭合成，并且NadC是其合成過程中的主要限速酶，NuoF與CydB等氧化還原酶作為輔酶促進電子在呼吸鏈上的傳遞，從而促進能量的釋放[41]。這些上調的基因說明低添加量底酸可能促進氧化磷酸化過程，進而加快了能量產生，有助于提高巴氏醋桿菌CICC 20001產酸效率。在醋酸發酵中后期，與輔因子和維生素代謝、能量代謝等通路有關的基因大多數被下調，可能是由于細胞中醋酸體積分數升高，降低了酶活，從而影響了能量代謝過程。由此可見，底物醋酸可能在醋酸發酵早期時的能量代謝中發揮著更加重要的作用。

圖5 巴氏醋桿菌CICC 20001醋酸發酵代謝圖Fig.5 Metabolic pathways in acetic acid fermentation by A.pasteurianus CICC 20001

3 結 論

前期研究表明，添加一定量的底物醋酸可以促進巴氏醋桿菌產酸。本研究采用轉錄組學方法探討添加0.5%底物醋酸促進巴氏醋桿菌產酸的分子機理。結果表明，以0.5%底物醋酸啟動醋酸發酵時，巴氏醋桿菌產酸效率明顯提高；在發酵早期和中后期，分別有412個和70個顯著差異表達的基因。這些基因涉及信號轉導、膜運輸、能量代謝、尿素代謝、丙酸代謝和醋酸同化代謝等。添加0.5%底物醋酸可能激發巴氏醋桿菌信號轉導過程，強化菌體對營養物質的跨膜運輸和能量代謝，可能為迅速開啟醋酸發酵提供物質和能量基礎。與此同時，巴氏醋桿菌還可能通過強化尿素代謝、丙酸代謝和醋酸同化代謝提高醋酸耐受性，減少發酵過程中醋酸對菌體的毒害作用，從而提高巴氏醋桿菌產酸效率。同時，將生理分析和轉錄組學與蛋白組學相結合的研究可能會闡明并加深對底物醋酸促進巴氏醋桿菌產酸分子機制的理解。