基于GC-IMS和HS-SPME-GC-MS的不同處理方式分析黑棗揮發性成分

王 越，王 連，王 愈*

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西 晉中 030801）

黑棗是棗果經高溫熟化而形成的深加工產品。棗果營養豐富[1]，多糖類、氨基酸在加熱的過程中極易發生美拉德反應[2]。張百剛[3]認為紅棗中含有多酚氧化酶，在加工的過程中會發生酶促褐變，使棗果的色澤發生改變以及風味產生變化。近年來隨著生活水平的快速提高，消費者對棗內在品質的要求越來越高，而風味是消費者最直觀的選擇依據，是評價其產品品質的重要指標，也能影響人們對食物食用口感好壞的一個關鍵因素[4]。棗果風味是由果實中大量的揮發性芳香物質混合而成，是棗果品質的重要組成部分[5]。揮發性有機化合物通常與食品風味有關，不同的處理方式會產生不同的揮發性有機化合物[6]。在紅棗風味成分檢測中多采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術，鮮見氣相離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）法在紅棗風味成分檢測中的應用。對棗果風味的研究集中在鮮棗[7-8]、干制棗[9]以及監控成熟過程中棗果特征風味物質的鑒定上[10]，對風味品質改善及工藝調控方式研究較少[11]。目前國內外對于黑棗的研究主要為工藝研究[12-15]。孫欣等[16]采用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）結合GC-MS方法對高溫高濕條件下成熟干制的黑棗樣品進行揮發性成分分析，共檢測出18種揮發性成分。宋建新[17]采用頂空（headspace，HS）-SPME-GC-MS聯用儀、電子鼻和快速氣相電子鼻等分析手段，研究棗果實成熟及干燥過程中的特征性香氣。閆新煥等[18]利用SPME-GC-MS分析鑒定紅棗片樣品的香氣成分及含量變化，3種不同干制方式處理的紅棗樣品的主要香味物質共有67種，其中酸類成分最多。劉莎莎等[19]采用HS-SPME-GC-MS分析檢測6種不同品種紅棗的香味物質，共檢測出34種主要香味物質。但是，由于GC-IMS數據庫限制，仍然存在一些物質無法直接定性[20]。本實驗采用GC-IMS結合HS-SPME-GCMS技術，對不同處理方式下黑棗中各種風味物質的變化進行檢測，分析風味物質與樣品類型之間的關系，比較揮發性香氣成分的差異，為黑棗加工褐變機制研究和工藝改進提供理論參考。同時進一步豐富黑棗特征風味物質的GC-IMS數據庫信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西太谷區半紅期（著色率50%）壺瓶棗為原料，2020年9月5日采摘于山西省晉中市太谷區小白鄉萬畝棗園。選取無機械損傷、無病蟲害的鮮棗，采收后均用打孔塑料袋包裝，裝箱運回山西農業大學食品科學與工程農產品貯藏與加工實驗室，放置4 ℃冷庫中備用。

甘氨酸 北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖 天津市北辰方正試劑有限公司；多酚氧化酶（1 560 U/mg）合肥博美生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Flavour Spec1H1-00053型GC-IMS聯用儀 德國G.A.S公司；Trace 1300 GC-MS聯用儀 美國Thermo公司；PR224ZH/E分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

根據Yu Hang等[21]的方法配制美拉德反應液。多酚氧化酶濃度為20 U/mL。

對照組：半紅期壺瓶棗挑選清洗后放置在小型玻璃發酵罐中在溫度為65 ℃、濕度為40%的恒溫恒濕培養箱中黑化15 d后，放置在80 ℃烘箱烘干至含水量為20%。記為CK。

三蒸三制處理組：蒸鍋中的水沸騰產生熱蒸汽后，將挑選清洗后的半紅期壺瓶棗常壓蒸制30 min，放涼轉入到溫度為65 ℃的電熱恒溫干燥箱中（無鼓風）1 h，反復3次，其他加工處理方法同對照組。記為Z+CK。

外源美拉德反應液處理組：半紅期壺瓶棗挑選清洗后在美拉德反應液中浸泡4 h后取出，其他加工處理方法同對照組。記為MF。

三蒸三制+外源美拉德反應液處理組：將經過三蒸三制處理后的半紅期壺瓶棗置于美拉德反應液中浸泡4 h后取出，其他加工處理方法同對照組。記為Z+MF。

外源多酚氧化酶處理：將半紅期壺瓶棗置于多酚氧化酶液中浸泡4 h后取出，其他加工處理方法同對照組。記為MC組。

三蒸三制+外源多酚氧化酶液處理組：將經過三蒸三制處理后的半紅期壺瓶棗置于多酚氧化酶液中浸泡4 h后取出，其他加工處理方法同對照組。記為Z+MC。

1.3.2 GC-IMS分析條件

HS進樣條件：孵化溫度40 ℃；孵化時間15 min；進樣針溫度85 ℃；進樣體積300 μL。

GC條件：MXT-5色譜柱（15 mh?.53 mm，1 μm）；柱溫60 ℃；初始流速2 mL/min，升至10 min時流速為10 mL/min，10～20 min，流速從10 mL/min升至120 mL/min。

IMS條件：漂移管長度5 cm；管內線性電壓400 V/cm；漂移氣流量150 mL/min；載氣/漂移氣N2；載氣流量0～2 min，2 mL/min；IMS溫度45 ℃。

樣品前處理：將6種不同處理方式得到黑棗產品放進組織絞碎機打碎，取粉碎樣品2 g裝入20 mL HS瓶中。將處理好的樣品在40 ℃孵育15 min后進樣300 μL。

1.3.3 GC-MS分析條件

參考宋建新方法[17]，并稍作修改。

HS萃取條件：稱取黑棗粉碎樣品2 g，置于20 mL螺口固相微萃取樣品瓶中，HS小瓶用聚四氟乙烯硅塞緊瓶蓋，旋緊瓶蓋后將樣品置于40 ℃條件下平衡15 min后，將聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（65 μm，PDMS/DVB）萃取頭插入HS小瓶中萃取30 min，最后將萃取頭拔出并置于250 ℃進樣口中解吸3 min。

GC條件：DB-WAX色譜柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；柱溫箱初始溫度40 ℃，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，載氣（He）載氣流速1 mL/min；柱溫箱升溫程序：40 ℃保持3 min，5 ℃/min升至120 ℃，10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min。

MS條件：離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度250 ℃；采用全掃描模式采集信號；質量掃描范圍m/z35～500。

1.4 數據處理

GC-IMS組分特征峰對應的保留時間和遷移時間可用于物質定性，檢測結果通過內置的NIST2014GC保留指數數據庫與G.A.S的IMS遷移時間數據庫二維定性。GC-MS檢測結果通過計算機標準物質質譜數據庫（NIST11）檢索處理，根據保留指數，統計匹配度大于80%的揮發性成分，并參考相關文獻定性鑒定檢出成分，確定揮發性物質的化學組成，按面積歸一法計算各成分的相對含量。數據分析采用儀器配套的分析軟件為LAV（Laboratory Analytical Viewer）和GChIMS Library Search（內置NIST2014、IMS數據庫）。利用Simca PCA插件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）；聚類分析熱圖利用Helm作圖；利用Origin2019b對分析結果進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理方式黑棗揮發性物質的GC-IMS分析

如圖1所示，橫坐標1.0處紅色豎線為反應離子峰（經歸一化處理），根據峰（色點）的有無或者顏色深淺能夠直觀表現不同樣品之間的組分及濃度差異。棗果經過三蒸三制處理后的紅點較多，說明黑棗中的揮發性組分經過高溫蒸制以及高溫干燥皺縮導致棗果細胞破裂，更多組分相互作用變得更加豐富，且組分含量越來越多。

圖1 不同處理方式下黑棗樣品中揮發性化合物特征峰位置點Fig.1 Characteristic peak location points in GC-IMS spectra of volatile organic compounds in black jujube samples

為了更加清晰地比較樣品間差異，采用差異對比模式，將不同處理方式的黑棗樣品繪制成二維差異圖譜，如圖2所示。差異圖譜以CK組樣品的譜圖作為參照，對比顯示剩余5個黑棗樣品的譜圖，紅色代表該物質在該樣品中濃度高于參照樣品，而藍色則代表低于參照樣品。三蒸三制后揮發性成分的含量明顯增多。同時可以觀察到Z+MC處理組沒有產生新的物質，多酚氧化酶在褐變過程中失活對黑棗揮發性風味物質的影響不顯著。

圖2 不同處理方式下黑棗的GC-IMS及其差異圖Fig.2 Raw and differential GC-IMS spectra of black jujube samples

通過揮發性物質的指紋譜圖（圖3），可以直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發性有機物差異，顏色深淺代表濃度高低，通過縱向比較，不同揮發性成分呈現一定的規律。

圖3 不同處理方式下黑棗揮發性成分GC-IMS差異圖譜Fig.3 Differential GC-IMS spectra of volatile organic compounds in black jujube samples

2.2 不同處理方式黑棗揮發性成分的GC-IMS和GC-MS分析

采用GC-IMS和GC-MS分析6種黑棗的揮發性成分，見表1、2，圖4～6。

表1 GC-IMS分析黑棗揮發性成分分析Table 1 Analysis of volatile components in black jujube by GC-IMS

續表1

表2 GC-MS分析黑棗揮發性成分分析Table 2 Analysis of volatile components in black jujube by GC-MS

續表2

續表2

由圖5結合表1可知，不同處理方式黑棗采用GC-IMS檢測出47種揮發性成分，這些有機物分子C鏈大多在C2～C18之間，包括醛類17種、醇類10種、酯類10種、酮類4種、呋喃類3種、酸類2種、其他1種，醛類化合物是黑棗主要的揮發性成分，相對含量為44%～47%。由圖6可知，不同處理方式黑棗采用GC-MS共檢測出128種揮發性成分，包括醛類21種、醇類23種、酯類20種、酮類16種、呋喃類3種、酸類20種、酚類4種、萜烯類12種、烷烴類9種。GC-MS和GC-IMS兩種檢測方法檢出的基礎風味物質種類基本一致。對比分析三蒸三制處理組（Z+CK、Z+MF、Z+MC）與未經過三蒸三制樣品黑棗共有風味物質，由圖4可知，共有風味物質為6～10種，多為壬醛、庚醛、糠醛、正己醛、苯甲醛、1-甲基環庚醇、2-乙酰基呋喃、冰醋酸。糠醛、庚醛、壬醛、正辛醛、冰醋酸為6種黑棗共有風味物質。

圖4 GC-MS和GC-IMS測定黑棗中風味物質Venn圖Fig.4 Venn diagram of flavor substances in black jujube determined by GC-MS and GC-IMS

圖5 GC-IMS測定黑棗中揮發性成分雷達圖Fig.5 GC-IMS radar chart of volatile organic compounds in black jujube

圖6 GC-MS測定不同處理方式黑棗揮發性風味物質相對含量變化Fig.6 Comparative relative contents of volatile flavor substances in different black jujube samples determined by GC-MS

2.3 黑棗中揮發性組分聚類分析

利用雷達圖對不同處理方式下黑棗的揮發性成分進行分類是不夠的。因此，采用PCA和聚類分析對不同處理方式下的黑棗揮發性成分進行分類[22]，樣本相似的聚集在一起。通過對PCA得分和載荷值找到相關的物質，各樣品的揮發性有機物數據是在相似信息的基礎上進行收集和分類，結果見圖7。

對表1中47種的化學物質按各自類別進行編號后（f1～f47），采用Simac PCA軟件進行PCA，提取2個PC，根據其貢獻值大小將其命名為PC1和PC2，累計貢獻率為74.3%。如圖7A所示，6個處理組被分成3個集群，不同處理的黑棗揮發性成分分離較好，具有明顯的區域分布。MF和Z+MF處理組處于第1象限，CK和MC處理組處于第3象限，Z+CK和Z+MC處理組處于第4象限。如圖7B所示，在47種揮發性成分中，糠醛（單體）、異丙醇、乙酸丁酯（二聚體）、乙酸甲酯、丁酸甲酯、2-丁酮、冰醋酸對黑棗風味有較大貢獻。其中，CK組的苯乙醛、苯甲醛（單體）、苯甲醛（二聚體）、1-戊醇（二聚體）、乙酸丁酯（二聚體）、乙酸乙酯（二聚體）、3-羥基-2-丁酮的含量顯著高于其他處理組；糠醛（單體）和3-甲基丁醛（單體）在Z+CK、Z+MF、Z+MC處理顯著增加；Z+CK處理乙酸甲酯、丙酮、冰醋酸的含量較多。Z+MC處理對黑棗風味特征物質的貢獻較小。

圖7 揮發性風味物質PCA得分圖（A）和散點圖（B）Fig.7 PCA score (A) and scatter plots (B) of volatile flavor compounds

2.4 黑棗中揮發性化合物熱圖分析

圖8 47種黑棗揮發性成分的熱圖Fig.8 Heat map of 47 volatile compounds in black jujube

根據圖8可以看出，CK與MF樣本中酯類水平最高，如乙酸乙酯、己酸甲酯、丁酸甲酯含量在CK中最高，而乙酸異戊酯、乙酸丁酯、丙酸丁酯在MF中含量最高。反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛、乙酸、丙酸等在Z+CK中含量最高；2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、2-呋喃甲醇等在MC中含量最高；2-乙酰呋喃在Z+MF中含量最高；各揮發性組分在Z+CK中的含量均高于其他樣本。

醛類是黑棗中的重要的香氣成分，由于不飽和脂肪酸的自動氧化作用產生了醛類的揮發性成分[23]。主要包括己醛（青草香）、反-2-己烯醛（青草香）、反-2-庚烯醛（蘋果、蔬菜味香）、苯甲醛（苦杏仁香）和反-2-壬烯醛（清香油脂香）、糠醛（面包、杏仁味）等醛類揮發性成分化合物。己醛和反式-2-己烯醛是由棗果中的亞油酸和亞麻酸在成熟過程中氧化產生[24]，是棗中特征香氣的重要組成成分，主要呈現出青香的風味。棗果在加熱過程中發生的美拉德反應，是黑棗香氣形成的主要因素。3-甲基丁醛、3-甲基硫基丙醛是支鏈醛等主要來源于Strecker降解反應[25]。棗果中的糖類與含氮類的氨基酸在加熱過程中以及抗壞血酸在熱降解中生成糠醛，經過三蒸三制后2種檢測方法糠醛的相對含量分別為34.055%與15.87%，與Sun Xin等[11]的研究結果一致。酮類化合物大部分是脂肪氧化產物和美拉德反應產物，一般對風味具有修飾作用。其中2種檢測方法中都檢測出的3-羥基-2-丁酮可能是美拉德反應第2階段中羥基和羰基碎裂作用的產物[26]，對黑棗風味的形成和增強有一定的貢獻。馮濤等[27]通過單純的糖與氨基酸反應得到的酮類化合物與本研究結果一致，由此可推測，酮類化合物的產生于與美拉德反應直接相關。醇類化合物是主要來源于氨基酸的轉化、發酵及亞麻酸降解物氧化，由醛進一步分解形成，大部分都具有令人愉快和圓潤的香氣特征，不同處理之間的差異不大[28]。酸類化合物一般閾值較高，不同處理方式加工的黑棗中酸類化合物的種類較少。但是，鮮棗中含有豐富的有機酸[29-30]，如蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、奎寧酸、草酸、富馬酸、樺木酸、齊墩果酸和熊果酸等，可以為酯化反應提供原料。黑棗中酯類化合物多數可能來自酯化反應和各種產物之間的相互反應[31]，如不飽和醛的氧化，在酶的作用下，棗果中的葡萄糖也可以通過生物合成形成酯類，此外糖還可以實現甜味和香味之間的感官相互聯動[32]。低級飽和單羧酸或多數的不飽和單有機酸與低級脂肪醇所形成的酯類都具有各種愉快的水果香氣。不同處理方式下酯類化合物的種類較少，相對含量較低；經過三蒸三制處理后酯類化合物的相對含量減少，2種檢測方法結果一致。酚類物質被描述為煙熏香、焦香味，一般閾值不大，對風味物質貢獻較大。呋喃化合物主要是美拉德反應和硫胺素熱降解的產物。萜烯類化合物具有檸檬香氣、柑橘香、藥草香、木香、青香、花香、甜香等香氣[33]，例如，β-蒎烯、萜品烯、羅勒烯、萜品油烯賦予了黑棗樣品清新草木香、花香、果香。棗中還有大量的烷烴類化合物，如十四烷、十六烷等，但烷烴類化合物一般是無味的，對棗香氣貢獻不大。

3 結 論

分別采用GC-MS和GC-IMS兩種檢測方法檢出的基礎風味物質種類基本一致。對比分析三蒸三制處理組（Z+CK、Z+MF、Z+MC）與未經過三蒸三制樣品黑棗共有風味物質。不同處理方式得到的主要揮發性成分各不相同，且不同處理黑棗的揮發性組分變化總趨勢基本一致，糠醛（單體）、異丙醇、乙酸丁酯（二聚體）、乙酸甲酯、丁酸甲酯、2-丁酮、冰醋酸對黑棗風味有較大的貢獻。其中，CK組的苯乙醛、苯甲醛（單體）、苯甲醛（二聚體）、1-戊醇（二聚體）、乙酸丁酯（二聚體）、乙酸乙酯（二聚體）、3-羥基-2-丁酮相對含量顯著高于其他處理組；糠醛（單體）和3-甲基丁醛（單體）在Z+CK、Z+MF、Z+MC處理顯著增加；Z+CK處理中乙酸甲酯、丙酮、冰醋酸相對含量較多。糠醛、乙酯和丙酮作為美拉德反應中的主要的芳香活性成分，表明黑棗經過三蒸三制處理后揮發性成分的增加，高溫高濕加熱過程中發生的化學反應對黑棗特有香氣的形成具有重要作用。多酚氧化酶在褐變的同時對黑棗揮發性風味物質的影響不顯著（P＞0.05）。Z+CK可以提高黑棗的品質和增加黑棗的風味，為改進黑棗加工工藝及褐變機制提供理論依據。同時說明，GC-IMS技術可以應用于快速鑒定和差異分析不同黑棗樣品揮發性成分。