基于TCGA數據庫篩選與胃癌進展和預后相關的潛在關鍵基因

劉婷 張紅2 萬億3 李曉宇 任明翰 王斌4 田字彬

(1 青島大學附屬醫院消化內科，山東 青島 266021； 2 青島大學基礎醫學院、公共衛生學院；3 青島大學基礎醫學院免疫學實驗室； 4 青島大學基礎醫學院特種醫學實驗室)

全球范圍內胃癌發病率居惡性腫瘤的第5位，居癌癥死亡原因的第3位，近年來胃癌的發病率呈逐年增加趨勢，進展期胃癌雖可進行手術、化療和放療等相關治療[1-3]，但在改善進展期胃癌患者的長期生存率方面還存在一定的局限性，因此迫切需要進一步的探索胃癌的發生機制和尋找主要的致病基因，為胃癌的精準治療提供數據參考。

近年來腫瘤分子標記物的早期檢測備受關注，腫瘤微環境(TME)與實體腫瘤的發生、發展密切相關，胃癌與TME的相關性也是目前胃癌研究的熱點之一[4-5]。TME是一個復雜的綜合系統,主要由腫瘤細胞及其周圍的免疫細胞、炎癥細胞、腫瘤相關的成纖維細胞以及附近的間質組織、微血管、各種細胞因子和趨化因子構成，TME的改變對腫瘤患者的療效和預后均會產生影響[6]。TME評分包括基質評分以及免疫評分，是采用ESTIMATE算法對TME中的基質細胞、免疫細胞以及腫瘤純度進行估計計算而得來。目前臨床普遍以TME評分作為篩選前列腺癌、結腸癌和乳腺癌的生物標記物的指標之一[7-10]。本研究首先通過運用CIBERSORT和ESTIMATE算法對TCGA數據庫中胃癌樣本計算基質評分以及免疫評分，然后分析基質評分、免疫評分與患者生存率以及胃癌臨床病理特征的相關性，篩選出與胃癌患者生存率和預后密切相關的差異表達基因(DEGs)，旨在為胃癌的臨床治療能夠提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 胃癌組織樣本基質評分和免疫評分與患者生存率的相關性分析

從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載胃癌組織及癌旁正常組織樣本的轉錄組RNA-seq數據，通過R語言軟件轉換后，再使用R語言中的“estimate”軟件包計算每個胃癌樣本的基質成份和免疫成份比例，進一步獲得基質評分和免疫評分；按照ESTIMATE算法中的要求，將基質評分和免疫評分以中位數為界限，分為高基質評分、低基質評分、高免疫評分、低免疫評分，繪制Kaplan-Meier生存曲線并進行Log-rank檢驗，分析胃癌患者樣本基質評分、免疫評分與患者生存率的相關性。

1.2 基質評分、免疫評分與胃癌患者臨床病理特征的相關性分析

下載TCGA數據庫中胃癌患者臨床病理學數據，包括grade分級(G1、G2、G3)、Stage分期(StageⅠ、StageⅡ、StageⅢ)、TNM分期(T分期、N分期、M分期)，再通過R語言軟件分析胃癌患者的臨床病理特征與樣本基質評分、免疫評分的相關性。

1.3 DEGs的初步篩選并進行KEGG和GO富集分析

對從數據庫中下載的胃癌組織與癌旁正常組織數據通過R語言軟件轉換以后，進一步通過R語言“limma”軟件包分析獲得胃癌組織與癌旁正常組織的DEGs。使用R語言“enrichplot”“ClusterProfi-ler”“ggplot2”和“org.Hs.eg.db”軟件包對初步篩選出的DEGs進行KEGG和GO富集分析，以P(調整后的P值)<0.05為差異有統計學意義。

1.4 構建蛋白質相互作用(PPI)網絡并篩選關鍵DEGs

通過STRING數據庫(https://string-db.org)對胃癌組織與癌旁正常組織的DEGs構建PPI網絡，以置信水平>0.9設為過濾值，使用Cytoscape(version 3.6.1，https://cytoscape.org)對PPI網絡進行評分及重構，提取網絡中的前150個DEGs。采用R語言“survival”軟件包對胃癌組織樣本進行單變量COX回歸分析，篩選出與胃癌患者生存具有顯著相關性的DEGs，以P<0.05為有統計學意義，并按照P值從小到大的順序進行排序。將單因素COX回歸分析獲得的DEGs與PPI網絡中的前150個DEGs取交集，獲得顯著DEGs。采用R語言軟件分別對獲得的每一個顯著DEGs在胃癌組織和癌旁正常組織中進行樣本配對分析、患者生存率分析以及臨床病理特征相關性分析以后，篩選出關鍵DEGs。

1.5 關鍵DEGs的基因集富集分析(GSEA)

通過R語言軟件對關鍵DEGs進行GSEA，以同時滿足P<0.05、NOMP<0.05、|NES|>1為有統計學意義。

1.6 TME中腫瘤浸潤性免疫細胞(TICs)類型及比例、TICs差異分析以及TICs與關鍵基因的相關性分析

通過CIBERSORT方法計算所有胃癌組織樣本TME中TICs的類型和比例。以關鍵DEGs表達水平的中位值為閾值，將關鍵DEGs分為高表達組和低表達組，對同一種TICs在關鍵DEGs高表達組和低表達組的占比與癌旁正常組織間進行差異分析，以P<0.05為有統計學意義，并對TICs與關鍵DEGs表達水平進行相關性分析，以P<0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 基質評分和免疫評分與胃癌患者生存率的相關性分析

從TCGA數據庫共下載胃癌組織及癌旁正常組織樣本407例，其中375例胃癌組織樣本，32例癌旁正常組織樣本。通過R語言軟件分析并計算胃癌組織樣本的基質評分和免疫評分，并繪制Kaplan-Meier生存曲線顯示，高基質評分與患者生存率呈負相關(P=0.030)(圖1A)，免疫評分與患者生存率無顯著相關性(圖1B)。

2.2 基質評分、免疫評分與胃癌患者臨床病理特征相關性分析

對基質評分、免疫評分與胃癌患者臨床病理特征進行相關性分析，結果顯示，基質評分和免疫評分均與胃癌grade分級、Stage分期、TNM分期的T分期呈顯著相關(P<0.05)，見圖2。基質評分和免疫評分與TNM分期的N分期及M分期不具有顯著相關性(P>0.05)。

2.3 DEGs的篩選及其KEGG和GO富集分析

通過R語言軟件分析后，共獲得胃癌組織與癌旁正常組織的DEGs 1 305個，其中1 070個DEGs表達上調，235個DEGs表達下調。進而對1 305個DEGs進行KEGG富集分析結果顯示，這些DEGs主要參與了免疫應答過程，其中排列在前4位的主要通路分別為細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、細胞黏附分子、B細胞受體信號通路和原發性免疫缺陷；GO富集分析結果顯示，DEGs主要參與免疫應答過程，如免疫反應激活表面受體信號通路、免疫反應激活信號轉導以及淋巴細胞免疫、體液免疫反應。

2.4 顯著DEGs的篩選及其與患者預后等相關性分析結果

對1 305個DEGs通過STRING數據庫構建PPI網絡，并使用Cytoscape提取出PPI網絡中的前150個DEGs。對胃癌組織樣本進行單因素COX 回歸分析，共篩選出18個與胃癌患者生存具有顯著相關性的DEGs，與PPI網絡提取出的150個DEGs取交集后，獲得5個顯著DEGs，分別為MCEMP1、HTR2A、PTGFR、F13A1和HGF。采用R語言軟件分別對上述5個顯著DEGs進行樣本配對分析，結果顯示，僅F13A1、MCEMP1在胃癌組織與癌旁正常組織中的表達有顯著差異(P<0.05)；患者的生存分析結果顯示，F13A1、MCEMP1低表達患者的中位生存時間均顯著高于高表達患者(P<0.05)；另一方面與臨床病理特征相關性分析顯示，F13A1、MCEMP1的表達與grade分級、Stage分期、TNM分期的T分期及N分期均顯著相關(P<0.05)，通過上述分析得出F13A1、MCEMP1為關鍵DEGs。

A:基質評分與患者生存率的相關性，B:免疫評分與患者生存率的相關性圖1 基質評分、免疫評分與患者生存率的相關性Fig.1 Correlation between Stromal Score and Immune Score and survival rate of patients

A:基質評分與胃癌grade分級的相關性；B:基質評分與胃癌Stage分期的相關性；C:基質評分與胃癌T分期的相關性；D:免疫評分與胃癌grade分級的相關性；E:免疫評分與胃癌Stage分期的相關性；F:免疫評分與胃癌T分期的相關性圖2 基質評分、免疫評分與胃癌患者臨床病理特征的相關性Fig.2 Correlation between Stromal Score and Immune Score and clinicopathological features of patiants with gastric cancer

2.5 關鍵DEGs的GSEA

關鍵DEGs的GSEA結果顯示，F13A1的高表達與結直腸癌、前列腺癌腫瘤相關通路以及JAK/STAT和MAPK信號通路顯著相關，MCEMP1的低表達與抗原加工和呈遞、半乳糖代謝、糖胺聚糖降解、自然殺傷(NK)細胞介導的細胞毒性、Nod樣受體信號通路、蛋白酶體和Toll樣受體信號通路具有相關性(P<0.05)。

2.6 關鍵DEGs與TICs比例的差異及相關性

CIBERSORT算法結果顯示，每一例胃癌組織樣本中含有22種TICs。F13A1、MCEMP1與22種TICs的相關性分析結果顯示，在F13A1高表達和低表達的胃癌組織樣本中，F13A1的表達與8種TICs存在顯著相關性(P<0.05)，其中M0巨噬細胞、T調節(Treg)細胞與F13A1的表達呈顯著負相關，活化的樹突狀細胞、靜息的樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、M2巨噬細胞、靜息的肥大細胞、單核細胞與F13A1的表達均呈顯著正相關(|R|>0.1)。另外MCEMP1的表達與14種TICs存在顯著相關性(P<0.05)，其中幼稚B細胞、靜息肥大細胞、活化的NK細胞、靜息忘記性CD4陽性T細胞、Treg細胞與MCEMP1的表達呈顯著負相關，活化的樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、M0巨噬細胞、M2巨噬細胞、活化的肥大細胞、中性粒細胞、靜息NK細胞、活化的CD4陽性細胞和γδT細胞與MCEMP1的表達呈顯著正相關(|R|>0.1)。

3 討 論

胃癌早期癥狀隱匿，大多數患者就診時已經處于進展期[11]，傳統的治療方式對于進展期胃癌的療效有限，進展期胃癌5年生存率不足10%。近年來分子靶向治療在胃癌領域有一定進展，但僅有部分人群獲益。TME在腫瘤的發生發展方面起著關鍵性的作用，因此從TME角度去探索腫瘤潛在的治療靶標對深入研究腫瘤的發病機制有著極其重要的意義和價值[12-13]。另外許多研究結果表明，TME與胃癌的發生、進展和轉移顯著相關[14-15]，TME中的TICs與胃癌患者的臨床預后密切相關[16]。

本研究通過下載TCGA數據庫中胃癌及癌旁正常組織樣本數據，計算胃癌患者樣本中基質成份及免疫成份比例，獲得基質和免疫評分，并對基質評分、免疫評分與患者生存及胃癌臨床病理特征進行了相關性分析，結果顯示基質評分越高，患者生存率越低、腫瘤組織分化程度越低、分期越晚，提示TME中的基質評分可能適用于預測胃癌患者的預后。為進一步分析DEGs的作用機制和途徑，本研究對胃癌組織與癌旁正常組織中的DEGs進行了KEGG及GO富集分析，提示所有DEGs主要參與了免疫應答過程。隨后通過對DEGs構建PPI網絡以及對胃癌組織樣本進行單變量COX回歸分析，進一步篩選得到5個顯著DEGs。通過對顯著DEGs在胃癌組織和癌旁正常組織中進行樣本配對分析，獲得2個關鍵DEGs。對關鍵DEGs在胃癌組織和癌旁正常組織中進行患者生存率分析以及臨床病理特征相關性分析，提示腫瘤組織分化程度越低、分期越晚、淋巴結受累越多，F13A1、MCEMP1表達水平越高，提示F13A1、MCEMP1參與了胃癌的發生發展，并且F13A1、MCEMP1的表達可能對胃癌的發展和患者的預后有著重要影響。為進一步分析關鍵DEGs參與的信號通路，以及進一步明確關鍵DEGs與TME之間的關系，本研究又對關鍵DEGs進行了GSEA并分析了關鍵DEGs與22種TICs的相關性，結果顯示F13A1、MCEMP1與多種TICs相互關聯，在胃癌TME中的表達對免疫細胞激活相關的信號通路和細胞毒性作用有較大影響。提示F13A1、MCEMP1是一種潛在的預后生物標志物，也許可作為胃癌的治療靶點。

研究發現F13A1、MCEMP1是胃癌的高危基因，可分別獨立用于預測胃癌患者的生存和預后。F13A1也稱為凝血因子A，是一種谷氨酰胺轉氨酶，可以交聯纖維蛋白形成穩定的血凝塊，也可在炎癥和血管生成過程中發揮作用。F13A1在血栓性疾病形成過程中充當重要角色，F13A1基因和蛋白在血漿中的表達水平及活性均與腫瘤的發生發展密切相關。另有研究表明F13A1與多種癌癥的增殖以及轉移有關，并且與M2巨噬細胞的極化顯著相關[17-19]。結合本研究結果，可以推測F13A1在胃癌的發展中起著促進作用。

MCEMP1主要由單核細胞和肥大細胞表達，編碼一種單向跨膜蛋白，可參與調節肥大細胞分化或免疫應答過程。腫瘤內肥大細胞的增加可促進免疫抑制和胃癌的進展[20-21]。研究發現，MCEMP1在調節機體免疫反應中起著重要作用，與先天免疫系統密切相關，其缺失可增加T淋巴細胞的活性、NK細胞的活性和免疫球蛋白的表達水平，抑制炎癥因子的釋放，誘導T淋巴細胞凋亡[22]。研究發現MCEMP1的高表達與膀胱癌的發生和患者不良預后顯著相關[20]。另外HU等[23]構建的胃癌患者預后的預測風險模型中也顯示，MCEMP1可以作為預測胃癌進展和預后的生物標記物。結合本研究結果，可以推測MCEMP1與胃癌的預后密切相關。

本研究結果顯示，F13A1、MCEMP1基因表達與M2巨噬細胞呈顯著相關。M2巨噬細胞又稱狹義的腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)，主要由單核細胞分化而來，腫瘤細胞分泌的集落刺激因子等趨化因子能招募外周血中的單核細胞到TME中，從而使單核細胞分化為巨噬細胞。據報道TAMs對甲狀腺乳頭狀癌與乳腺癌的細胞增殖、血管生成、免疫抑制起著促進作用[24-25]。有研究證明胃癌TME中浸潤的TAMs以M2亞型巨噬細胞為主，發揮著促進腫瘤生長、侵襲和轉移的作用[26]。本研究結果提示，隨著F13A1、MCEMP1表達水平的上調，存在于胃癌TME中的主導反應從抗腫瘤免疫反應轉變為促進腫瘤細胞代謝反應。此外本研究GSEA結果也提示，F13A1表達與JAK/STAT和MAPK等腫瘤相關的信號通路具有顯著相關性，這也提示F13A1、MCEMP1可能與胃癌的發展和患者的預后具有密切相關性。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法篩選了與胃癌的進展和患者的預后相關的關鍵基因。研究發現在胃癌的TME中，F13A1、MCEMP1高表達對胃癌的發展起著促進作用，與胃癌患者的臨床預后密切相關，對胃癌患者的預后預測和治療指導有重要意義。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：劉婷、王斌、田字彬參與了研究設計；劉婷、李曉宇、張紅、萬億、任明翰、田字彬參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions： The study was designed byLIUTing,WANGBin, andTIANZibin. The manuscript was drafted and revised byLIUTing,LIXiaoyu,ZHANGHong,WanYi,RENMinghan, andTIANZibin. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.