GluA2亞基內吞阻滯穿膜環肽CMT-3Y的設計合成與評價

嚴志祥 韓帥 陳積 祝青曄 董銘心

(1 青島大學基礎醫學院特種醫學系，山東 青島 266021； 2 青島大學藥學院； 3 青島大學附屬青島市婦女兒童醫院麻醉科)

Tat序列可介導生物大分子進入細胞，并有生物相容性高、毒副作用低等優點。但是Tat的遞送效率，特別是從內吞小泡逃逸的效率亟待提高[5]；同時，在體內應用時還面臨血漿耐受性差的問題[6-7]。解決Tat等細胞穿膜肽(CPPs)的缺陷一直是多肽藥物領域的研究熱點。有研究結果顯示了一系列兩親性CPP的環肽，其胞漿遞送效率高達7.5%～121.0%(相比之下Tat為2.0%),這些環狀CPP直接與質膜磷脂結合，通過內吞作用進入哺乳動物細胞內，然后從內吞小泡體內有效釋放[5,7-8]。兩親性CPP設計原則包括：引入機體內酶不能識別的非天然氨基酸以及D型氨基酸，從而能夠提高多肽的穩定性；引入含脂肪族側鏈的非天然氨基酸，降低多肽藥的極性，提高多肽藥物穿透能力；增加一定長度的聚乙二醇(PEG)修飾，既可提高多肽藥膜滲透性和穩定性，同時又能將CPP與活性基團拉開一定距離以保持多肽藥物的活性，但隨著PEG的延長，會導致相對分子質量過大，不利于維持藥物的穿膜效率。本研究在環狀CPP的設計中引入含脂肪族側鏈非天然氨基酸、D型氨基酸和長度最短的聚乙二醇(miniPEG)，設計GluA2亞基內吞阻滯穿膜環肽CMT-3Y，旨在提高3Y的穿膜能力、神經保護活性和血漿穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

各種Fmoc保護的氨基酸(L/D)、非天然氨基酸以及合成所需的原料均購于北京偶合試劑有限公司，反相高效液相色譜(RP-HPLC)為安捷倫1220(分析型)和1260(制備型)、PC-12(高分化)細胞系購自于北京中科質檢生物技術有限公司，MDCK-MDR1細胞系購于青旗(上海)生物技術發展有限公司，CCK8試劑購于上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1CMT-3Y和陰性對照3Y的合成及表征方法CMT-3Y和陰性對照3Y均采用文獻報道的固相合成方法合成[8]。用RP-HPLC 1260對合成的多肽進行純化，色譜柱為Positisil反相C18(半制備型)5 μm，4.6 mm×250 mm，流量為3 mL/min，色譜條件：水相為去離子水+體積分數0.000 5的三氟乙酸(TFA)；有機相為乙腈+體積分數0.000 5的TFA，在體積分數0.1～0.7乙腈中梯度洗脫，時間為35 min，檢測波長為280 nm。稱量純肽質量并計算肽分離收率，肽分離收率=實際純化量/理論純化量。用RP-HPLC 1220分別分析陰性對照3Y和CMT-3Y的粗肽和純肽的色譜純度表征，色譜柱為Positisil OSD-P反相C18(分析型)5 μm，4.6 mm×250 mm，流量為1 mL/min,色譜條件與純化的相同，在體積分數0.1～0.9的乙腈中梯度洗脫，時間為32 min，檢測波長為280 nm。用質譜表征陰性對照3Y和CMT-3Y的相對分子質量。

1.2.23Y、Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y穿膜效率評價方法 將MDCK-MDRI細胞以1.7×105個鋪入Transwell板小室頂端(AP側)中，在AP側加入含體積分數0.1胎牛血清的DMEM培養基，然后將Transwell板置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中培養，分別在第1、3、5、7天采用相關文獻報道的方法[9]用電阻儀測量電阻值，并且在Transwell板AP側加入400 μL終濃度為20 mg/L的熒光黃，與細胞共同孵育3 h后，在激發光波長為427 nm、發射光波長為536 nm處用酶標儀檢測熒光黃的吸光度(A)值。通過熒光黃的表觀滲透系數(Papp)值和電阻值來評估模型的緊密連接性，當培養至第7天細胞緊密連接性良好時，分別將陰性對照組3Y、陽性對照組Tat-GluA2-3Y以及實驗組CMT-3Y用HBSS緩沖液配制成500 mg/L的濃度。取400 μL各組藥物分別加入至培養7 d且電阻值符合要求的Transwell板小室AP側的細胞中，同時Transwell板基底側(BL側)加入600 μL HBSS緩沖液，與細胞共孵育3 h，從BL側取樣并采用RP-HPLC檢測各藥物滲透濃度，各組實驗重復3次，結果取均值，計算各組Papp值。

將陰性對照組3Y、陽性對照組Tat-GluA2-3Y以及實驗組CMT-3Y用HBSS緩沖液各配制成500 mg/L的質量濃度。取100 μL各組藥物加入至平行人工膜滲透模型(PAMPA)的上方(AP側)，在基底側(BL側)加入370 μL HBSS緩沖液，避光室溫孵育3 h，然后取BL側液體進行RP-HPLC檢測，實驗重復3次，結果取平均值，同時計算各組藥物的Papp值。

1.2.33Y、Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y神經保護活性評價方法 將PC-12細胞以4×103個/孔鋪入96孔板中，在含體積分數0.10胎牛血清的DMEM、37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中培養24 h。將細胞分為空白組(只加入配Glu用的溶劑)、模型Glu組、藥物組(分別為0.001、0.010、0.050、0.100、1.000 mmol/L陰性對照組3Y、陽性對照組Tat-GluA2-3Y和實驗組CMT-3Y)，用文獻報道的方法構建Glu誘導的PC-12細胞神經興奮損傷模型[10]，同時各組給予各濃度藥物進行處理。模型構建24 h后各孔加入20 μL CCK8共孵育2 h，在波長450 nm處用酶標儀檢測各組細胞的吸光度(A)值，實驗重復5次，結果取均值，計算不同濃度下各組細胞存活率和半數最大效應濃度(EC50)。

1.2.4Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y在不同時間點體外血漿中的穩定性評價方法 采用相關文獻報道的方法[11]進行體外血漿穩定性評價，將Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y分別用去離子水配制成10 g/L的濃度，分別取100 μL兩組多肽加入100 μL的大鼠血漿中使其終濃度為5 g/L，置于37 ℃烘箱中孵育0、0.5、1.0、2.0、4.0，6.0、12.0、24.0 h。每組實驗重復3次，結果取均值，比較不同時間Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y的酶降解率。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 3Y合成結果

3Y(Ac-YKEGYNVYG-NH2，結構式見圖1A)在以去離子水(含體積分數0.000 5的TFA)-乙腈溶液(含體積分數0.000 5的TFA)60∶40為流動相情況下出峰，粗肽色譜純度為88.53%，純化以后色譜純度則為98.54%(見圖1B)，3Y分離收率為59.8%。3Y理論相對分子質量為1 133.50，測得相對分子質量為1 133.61(見圖1C),兩者相對分子質量一致。

A：3Y結構式，B：3Y的RP-HPLC圖譜，C：3Y質譜圖

2.2 CMT-3Y的合成結果

CMT-3Y序列見圖2A,結構見圖2B。在以去離子水(含體積分數0.000 5的TFA)-乙腈溶液(含體積分數0.000 5的TFA)70∶30為流動相情況下出峰，粗肽色譜純度為69.54%，純化后色譜純度為99.36%(圖2C)，分離收率為46.06%，CMT-3Y理論相對分子質量為2 317.168，測得相對分子質量為2 317.156(圖2D),兩者相對分子質量一致。

A:CMT-3Y序列(&代表L-2-萘丙氨酸，#代表miniPEG)，B:CMT-3Y結構圖，C:CMT-3Y的RP-HPLC圖，D:CMT-3Y質譜圖

2.3 穿膜活性評價

2.3.1MDCK-MDR1跨膜轉運模型的可靠性評價MDCK-MDR1跨膜轉運模型在培養第7天時的電阻為(305.09±3.56)Ω·cm2(圖3)，熒光黃滲透評價測得Papp值為3.57×10-7cm/s，在第1、3、5天的熒光黃滲透評價的Papp值分別為1.03×10-2、2.34×10-4、4.98×10-5cm/s,說明MDCK-MDR1在第7天能夠形成緊密連接良好的致密單層，可以用于藥物穿膜評價。

圖3 不同時間點MDCK-MDR1細胞在Transwell板中的電阻參數

2.3.23Y、Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y的穿膜效率評價結果 在MDCK-MDR1跨膜轉運模型上Tat-GluA2-3Y的Papp值為(2.56±0.05)×10-5cm/s，CMT-3Y為(9.33±0.03)×10-5cm/s，CMT-3Y的穿膜效率約是Tat-GluA2-3Y的3.6倍，兩者間比較差異具有顯著統計學意義(t=170.57，P<0.01)；在PAMPA模型上Tat-GluA2-3Y的Papp值為(3.55±0.06)×10-5cm/s，CMT-3Y的值為(9.59±0.03)×10-5cm/s，CMT-3Y的穿膜效率約是Tat-GluA2-3Y 2.7倍，兩者間比較差異有顯著意義(t=138.80，P<0.01)。3Y在兩個模型上通過RP-HPLC均未檢測出。

2.4 不同濃度的Tat-GluA2-3Y、CMT-3Y和3Y的神經保護活性評價

析因設計的方差分析結果顯示，藥物濃度、組別、濃度和組別的交互作用對模型Glu組、空白組、Tat-GluA2-3Y組、CMT-3Y組和3Y組的細胞存活率有明顯影響(F濃度=94.54，F組間=108.67，F交互=31.15，P<0.01)；且隨著藥物濃度的上升，Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y組的細胞存活率也隨之提高(F=31.46、65.49，P<0.01)，而3Y組不同濃度間的細胞存活率差異無顯著性(P>0.05)；模型Glu組中細胞的存活率為(10.57±4.81)%，空白組為(100±0.04)%，3Y組與模型Glu組間細胞存活率比較差異無顯著意義(P>0.05)，而空白組、Tat-GluA2-3Y組和CMT-3Y組與模型Glu組間細胞存活率比較差異均有顯著統計學意義(P<0.01)，其中CMT-3Y組的細胞存活率高于Tat-GluA2-3Y組(P<0.05)。見表1。此外，Tat-GluA2-3Y組的EC50值為(50.62±3.60)μmol/L，CMT-3Y組為(35.53±5.47)μmol/L，兩者EC50值比較差異具有顯著統計學意義(t=4.60，P<0.05)。

表1 Glu誘導損傷的PC12細胞在Tat-GluA2-3Y、CMT-3Y和3Y中的存活率

2.5 Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y不同時間點血漿穩定性比較

重復測量設計的方差分析結果顯示，時間、組別、時間和組別交互作用對血漿中酶降解率具有明顯影響(F時間=40 742.07，F組別=38 998.63，F交互=9 323.67，P<0.01)；且隨著血漿孵育時間的延長，Tat-GluA2-3Y組和CMT-3Y組在血漿中酶降解率隨之升高(F組內=17 702.36、58 347.85，P<0.01)；各時間點Tat-GluA2-3Y組酶降解率高于CMT-3Y組，差異均具有統計學意義(F=21.75～914 199.40，P<0.01)。見表2。

表2 Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y在血漿中酶降解率比較

3 討 論

多肽藥物具有高生物活性、高專一性和低毒性等優點，在臨床應用廣泛[12]。然而，線性多肽的首尾端有游離的氨基和羧基，且極性較高，因此線性多肽具有半衰期短和透膜性差等缺陷。環肽可降低藥物的極性及封閉裸露的氨基和羧基，從而提高藥物的穿膜能力和血漿穩定性，是多肽藥物研究熱點。本研究設計并合成了環化的兩親性CPP的CMT-3Y，結果顯示，該環肽提高了藥物的穿膜效率、神經保護活性和血漿穩定性，為多肽修飾提供了研究的思路。

本研究中采用的MDCK-MDR1細胞系是以人源MDR1基因穩定轉染MDCK細胞而成，該細胞系能夠表達極性化的P-gp蛋白，常用于構建評價化合物穿透血腦屏障和腸道黏膜能力的體外快速篩選模型[9]。本研究結果顯示，用MDCK-MDR1細胞構建穿膜模型時，電阻值在第5天達到了高峰，為(425.21±4.45)Ω·cm2，隨后呈下降趨勢，第7天時電阻值達(305.09±3.56)Ω·cm2，電阻值變化情況與目前相關的研究結果一致[9]。研究表明，當電阻值>150 Ω·cm2時，細胞已形成了緊密連接性[13]。本研究MDCK-MDR1跨膜轉運模型電阻值在第5天已達標準，但熒光黃Papp值仍超過2×10-6cm/s，未達到相關研究報道的標準[14],當第7天時熒光黃的Papp值為3.57×10-7cm/s(<2×10-6cm/s)，才符合實驗要求。MDCK-MDR1跨膜轉運模型在細胞完成分化、形成致密單層且電阻值符合要求的條件下可以用于穿膜評價,該模型在第2～3天即可形成致密單層，但細胞完成分化則需要6～7 d[9]。本研究中熒光黃的Papp值在第7天時達到標準，MDCK-MDR1跨膜轉運模型可用于穿膜評價。

本研究結果顯示CMT-3Y的穿膜效率是Tat-GluA2-3Y的3～4倍，穿膜效率大幅提高但增加的倍數不及文獻報道的結果[15]。文獻報道環狀CPP偶聯的貨物為熒光素，相對分子質量相對較小，且其穿膜效率檢測是通過統計環狀CPP偶聯的熒光素貨物在細胞內的發光值，該檢測方式不能夠模擬藥物在體內的穿膜情況。而本研究采用的MDCK-MDR1跨膜轉運模型不僅能評價藥物的胃腸道穿膜能力，還能評價穿透血腦屏障的能力，可更好地模擬藥物在體內穿膜情況；此外，PAMPA是由帶負電的磷脂雙分子層組成，可更好地模擬藥物在體內被動轉運的能力，是藥物穿膜能力篩選的有力模型。

多肽藥物的穿膜效率受到多種因素的影響。一方面，會受到多肽藥物極性大小的影響，本研究通過RP-HPLC檢測的結果顯示，CMT-3Y的極性小于Tat-GluA2-3Y。CMT-3Y上環兩親性CPP與Tat相比，環兩親性CPP中含有非極性側鏈的非天然氨基酸，降低了多肽向細胞膜遷移過程中的吉布斯自由能，進而提高了多肽藥物被動轉運能力。另一方面，Tat和采用的環兩親性CPP均含有一定數目帶正電荷的精氨酸，其與細胞膜表面產生的靜電作用使細胞膜變薄，能夠通過主動攝取的方式瞬時穿透細胞膜[16]。而將CPP環化后能夠降低其與細胞膜結合的熵損失[17]，故環化后的兩親性CPP穿膜效率更高。此外，CPP氨基酸數目亦能影響多肽藥物的穿膜效率，本研究CMT-3Y中的CPP中有7個氨基酸，而Tat-GluA2-3Y的Tat有11個氨基酸，因此CMT-3Y的氫鍵受體和氫鍵供體數目較少。相關研究表明藥物氫鍵受體和氫鍵供體數目越少，其穿膜效率越高[18-19]。

高分化狀態的PC-12細胞能夠表達神經元的表型，高分化狀態的PC-12細胞也表達AMPA受體的A2亞基[20]。此外，本研究中的空白組細胞存活率與模型Glu組比較差異具有顯著性，說明PC-12細胞的神經興奮性損傷是由Glu介導的，與相關研究結果一致[10]，故高分化狀態的PC-12細胞可用于本研究的細胞活性評價。本研究中CMT-3Y的EC50值低于Tat-GluA2-3Y，說明CMT-3Y具有較高的神經保護活性。本研究結果顯示，藥物的活性大小與穿入細胞的藥量有關，一方面，Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y的活性基團相同，但CMT-3Y穿透細胞的能力更強，因此CMT-3Y的神經保護活性優于Tat-GluA2-3Y；另一方面，在一定范圍內藥物濃度越高，穿入細胞的藥物含量越多，Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y神經保護活性也隨之增強。CMT-3Y的活性高與其穩定性高也有關，在細胞內穩定存在，活性片段能夠更好地發揮生物活性。此外，本研究中CMT-3Y的CPP與活性基團的距離要大于Tat-GluA2-3Y，相關研究表明，CPP與活性基團保持一定的距離能夠提高多肽藥物的活性[8]。

本研究結果顯示，隨著時間的延長Tat-GluA2-3Y以及CMT-3Y在血漿中酶降解率均會上升，但是Tat-GluA2-3Y在血漿中12 h降解了約95%，而CMT-3Y在24 h才降解了約57%，表明CMT-3Y的血漿穩定性更好。一方面，環肽通過限制構象，增強了多肽的剛性，增大反應間原子的距離，減少識別氨基和羧基的特定蛋白酶的水解；另一方面，CMT-3Y中含有3個D型氨基酸和1個非天然氨基酸，血漿中的酶主要識別L型氨基酸，不能識別D型氨基酸和非天然氨基酸。相關研究表明，將L型氨基酸轉變為D型氨基酸，能夠提高藥物的穩定性[21]；此外，一定長度下的PEG修飾在提高血漿穩定性方面也發揮著效應，PEG能夠改變多肽的理化性質，封閉多肽的正電荷，防止血漿蛋白與多肽結合，提高其穩定性[22]。

綜上所述，CMT-3Y依靠其含有脂溶性側鏈基團以及較短的多肽鏈等優勢使穿膜效率高于Tat-GluA2-3Y。此外，CMT-3Y引入了非天然氨基酸、D型氨基酸、PEG以及環化的兩親性CPP，從而能夠避免血漿中一些酶的水解，提高了CMT-3Y的血漿穩定性。由于CMT-3Y的高穿膜效率、高穩定性以及環狀CPP與活性基團保持有一定距離，從而使CMT-3Y具有較高的神經保護活性。本研究可為多肽藥物的修飾改造提供思路和數據支持。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：嚴志祥、韓帥、陳積、祝青曄和董銘心參與了研究設計；嚴志祥、董銘心參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions： The study was designed byYANZhixiang,HANShuai,CHENJi,ZHUQingye, andDONGMingxin. The manuscript was drafted and revised byYANZhixiangandDONGMingxin. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.