KIF11在結直腸癌中的表達及其與患者臨床病理特征和預后的關系

王璐 陳陽 喬業華 張翔雁 邢曉明

(1 青島大學基礎醫學院病理學系，山東 青島 266021； 2 青島大學附屬醫院病理科)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)在全球常見癌癥和常見癌癥死亡原因中分別位列第3、第4位，發病率占所有癌癥患者的10.2%，病死率占所有癌癥患者的9.2%[1]。早期篩查的普及和確診后的靶向治療可有效降低CRC的發病率及病死率，但根據全球癌癥統計報告顯示，在2018年仍大約有180萬新增CRC患者以及88萬死亡患者[2]。因此，研究CRC發生發展的分子機制，尋找診斷與治療的分子靶向標記物對提高CRC患者臨床療效和降低病死率具有重要意義。 驅動蛋白是調控細胞分裂及細胞內囊泡和細胞器運輸的關鍵蛋白，驅動蛋白家庭成員11(KIF11)是驅動蛋白家族成員之一，屬于N-2型有絲分裂驅動蛋白。KIF11是雙極紡錘體形成過程中分離重復中心體所必需的關鍵成分[3-6]，其由1 057個氨基酸殘基組成，由位于10q24.1的KIF11基因編碼[7-9]。研究表明，KIF11基因在口腔癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中高表達，可促進相關腫瘤的發生和發展[10-16]。目前驅動蛋白家族與腫瘤的相關性研究越來越深入，但是關于KIF11在CRC組織當中的表達與作用鮮有報道[17-20]。有研究采用免疫印跡實驗及實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測KIF11基因在CRC組織中的表達水平[17]。本研究采用免疫組織化學方法(IHC)檢測KIF11在CRC組織中的表達情況，進而分析其表達水平與患者臨床病理特征及預后關系，探討KIF11在CRC發生發展中的作用機制?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集2015年4月—2016年4月于青島大學附屬醫院行手術切除的380例CRC患者的腫瘤組織及相應的癌旁(距腫瘤邊緣>5 cm)正常組織樣本。患者男230例，女150例；年齡28～91歲，平均為(64.3±0.6)歲。所有患者臨床病理資料完整，且術前均未接受放化療治療。電話隨訪所有患者生存狀態、生存時間以及腫瘤復發情況等指標，隨訪截至2018年5月31日。臨床病理分期依據美國癌癥聯合委員會(AJCC)/國際抗癌聯盟(UICC)制定的TNM分期系統(第8版)。本研究經青島大學附屬醫院倫理委員會批準(QYFYWZLL26608)。

1.2 實驗試劑

KIF11兔抗人多克隆抗體(ab61199)購自于美國Abcam公司；羊抗兔抗體(A0545)購自于美國Sigma公司，工作濃度為1∶200；PV-6000 IHC檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1組織芯片制備 由兩名專業病理醫師對蘇木精-伊紅(HE)染色組織切片閱片，顯微鏡下觀察并標記代表性區域，使用組織儀制作孔徑為2.0 mm的CRC組織芯片，連續4 μm厚切片。

1.3.2IHC染色 組織芯片經脫蠟、水化后進行過氧化物酶阻斷，高壓修復法進行抗原修復(枸櫞酸鹽pH 6.0)，滴加濃度為1∶500的KIF11兔抗人多克隆抗體；同時將不加KIF11一抗的PBS作為陰性對照，4 ℃孵育過夜；滴加羊抗兔抗體二抗，室溫孵育30 min；DAB顯色，使用蘇木精進行復染。

1.3.3IHC結果判讀 由兩名資深病理科醫師在未知腫瘤級別情況下進行雙盲閱片，顯微鏡下觀察，以細胞質或細胞核中呈棕黃色或棕褐色染色為陽性表達。按照著色強度進行計分：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分[21]。根據IHC評分標準將380例CRC組織樣本分為KIF11高表達組(≥2分)和KIF11低表達組(<2分)。

1.4 統計學處理

使用SPSS 26.0軟件對數據進行統計學分析。KIF11蛋白表達水平與CRC患者臨床病理特征的關系采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法及Log rank檢驗；采用Cox比例風險回歸模型對影響患者術后生存時間的因素進行單因素和多因素分析。并使用GraphPad Prism 8.3.0軟件繪制KIF11的表達水平與CRC患者預后的生存曲線。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 CRC患者腫瘤組織及癌旁正常組織中KIF11蛋白表達水平

IHC染色結果顯示，KIF11在癌旁正常組織中呈弱陽性表達或不表達(圖1A)，在CRC組織中呈高表達(圖1B)。所有樣本中，126例(33.16%)腫瘤組織樣本中KIF11呈高表達，12例(3.16%)癌旁正常組織樣本中KIF11呈高表達，兩者比較差異有統計學意義(χ2=382.956，P<0.05)。

A：癌旁正常組織，B：腫瘤組織，100倍

2.2 CRC患者腫瘤組織中KIF11的表達水平與臨床病理特征的相關性

KIF11的表達水平與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移以及浸潤深度有關(χ2=4.018～11.334，P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、是否遠處轉移等無關(P>0.05)。見表1。

表1 CRC患者腫瘤組織中KIF11表達水平與臨床病理特征的關系[例(χ/%)]

2.3 CRC患者KIF11表達水平與術后生存的關系

根據隨訪結果繪制患者的Kaplan-Meier生存曲線，結果顯示，KIF11低表達組和KIF11高表達組患者的總生存期(OS)分別為(49.862±0.511)、(49.146±1.216)月，無病生存期(DFS)分別為(49.688±0.553)、(46.331±1.183)月，KIF11低表達組和KIF11高表達組的生存比例分別為93.3%、84.1%，兩組患者的上述預后指標比較差異均具有統計學意義(χ2=6.470～8.254，P<0.05)。見圖2A、B。

A：OS，B：DFS

2.4 CRC患者預后的影響因素分析

進一步對CRC患者預后進行Cox單因素回歸模型分析，其中二分類及多分類自變量賦值如下：KIF11表達水平(低表達組=參照)；淋巴結轉移(M0=參照)；TNM分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2，Ⅳ期=3)，浸潤深度(T1=0，T2=1，T3=2，T4=3)。單因素分析結果顯示，腫瘤組織中KIF11表達水平和腫瘤浸潤深度為影響CRC患者OS與DFS的危險因素(P<0.05)。再進行多因素分析結果顯示，KIF11的表達水平和腫瘤浸潤深度為影響CRC患者OS和DFS的獨立危險因素(P<0.05)。詳見表2、3。

表2 CRC患者OS影響因素分析

表3 CRC患者DFS的影響因素分析

3 討 論

CRC是全球最常見的惡性腫瘤之一，每年約有90萬人死于CRC。新輔助放化療、免疫治療及靶向治療等治療方案能夠使CRC患者術后總體生存率顯著增高。但目前醫學界對于CRC進展的分子機制研究尚未十分深入，因此進一步研究CRC進展的分子機制對降低晚期CRC患者的病死率具有重要意義。

KIF11是在非洲爪蟾體內提取并鑒定出的一種與有絲分裂紡錘體形成相關的驅動蛋白，是由頭部馬達結構域構成的同源四聚體，該馬達結構域由340個氨基酸殘基組成，包括ATPase位點及微管結合位點。KIF11可以交聯兩個相鄰微管，使每個二聚體運動單元與單個微管相互作用。研究表明，細胞中的紡錘體位點會因藥物干擾或KIF11的功能被抑制而激活，進而導致有絲分裂受阻，發生細胞凋亡，表明KIF11在有絲分裂過程中發揮重要作用[5,22]。另有研究表明，KIF11在有絲分裂開始時對中心體的遷移和穩定性必不可少，因此對雙極中期紡錘體的形成也發揮著重要作用[3-4,23]。當驅動蛋白異常表達時，有絲分裂過程中會產生額外的外力致使姐妹染色單體過早分離和染色體分布不均，紡錘體形成異常，細胞分裂缺陷，從而導致細胞內遺傳物質的分布發生改變，引起子代細胞眾多功能異常,最終可能導致腫瘤發生[5]。

近年來大量研究證實，KIF11可通過調節有絲分裂過程中紡錘體的形成進而促進腫瘤細胞惡性生物學行為，包括細胞侵襲、轉移、增殖及凋亡，其異常高表達與患者不良預后密切相關[16,24-26]。研究表明，KIF11基因在多種腫瘤組織及疾病中的表達均上調[26-29]。本研究采用IHC方法對CRC組織和癌旁正常組織中KIF11蛋白的表達情況進行分析，顯示KIF11蛋白在CRC組織中表達上調，但在癌旁正常組織中呈低表達狀態，由此可以推斷KIF11基因與CRC的發生有一定相關性。有研究顯示，KIF11基因可促進乳腺癌及肝癌患者癌細胞增殖，促進小鼠胰腺癌細胞增殖及腫瘤形成[11,13,15,29]。最近，有研究報道KIF11是CRC中最常見的失調性驅動蛋白之一，沉默KIF11基因則可以顯著抑制CRC細胞增殖和腫瘤生長，提示KIF11基因可能是通過促進腫瘤細胞增殖過程進一步影響CRC的進展[17]。

本研究結果顯示，KIF11蛋白的表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤浸潤深度顯著相關。通過繪制CRC患者的Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，KIF11高表達組的CRC患者術后OS和DFS均短于低表達組，提示KIF11可能參與了CRC的侵襲與轉移過程。進一步行單因素和多因素分析結果顯示，KIF11高表達組患者的生存狀態與KIF11低表達組患者的生存狀態之間存在統計學差異，高表達KIF11的CRC患者生存比例顯著低于低表達者。同樣，KIF11的高表達水平和腫瘤浸潤深度增加是影響CRC患者OS和DFS的獨立危險因素。以上結果均表明KIF11的表達水平與CRC患者的發生發展及預后密切相關，KIF11高表達組患者可能更容易發生腫瘤的浸潤和侵襲。總之，目前對于KIF11與CRC發生發展的具體分子機制研究甚少，有待于日后更深入的研究。

綜上所述，KIF11在CRC組織中呈高表達，且與患者腫瘤TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤浸潤深度密切相關，可能對CRC的發生發展和浸潤轉移發揮促進作用，KIF11基因有望成為CRC新的分子治療靶點。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest: All authors disclose no relevant conflicts of interest.