擬南芥F-box蛋白FKF1與轉(zhuǎn)錄因子FUL互作調(diào)控開花研究

周娟 閻晉東 李新梅 劉雪晴 趙強(qiáng) 趙小英

（湖南大學(xué)生物學(xué)院 植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南省雜交油菜工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410082）

開花是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中一個(gè)非常關(guān)鍵的階段，受各種內(nèi)源和外源因素影響［1］。擬南芥中主要有6種開花途徑：光周期、春化、溫度、赤霉素、年齡和自主途徑［2-4］。這些信號(hào)途徑既彼此獨(dú)立又相互交聯(lián)，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終將開花信號(hào)匯聚到幾個(gè)關(guān)鍵的開花整合因子如FLOWERING LOCUS T（FT），TWIN SISTER OF FT（TSF） 和 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1（SOC1）等，從而激活花分生組織決定基因的表達(dá)如 LEAFY（LFY），F(xiàn)RUITFULL（FUL），CAULIFLOWER（CAL）和 APETALA1（AP1）等［5-10］，進(jìn)而啟動(dòng)植物成花。

在擬南芥中，CONSTANS（CO）對(duì)FT基因表達(dá)的調(diào)控對(duì)于光周期開花至關(guān)重要［11-13］。F-box蛋白FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-BOX 1（FKF1）作為藍(lán)光受體參與植物體內(nèi)光信號(hào)傳導(dǎo)［14-15］。FKF1在下午時(shí)段通過(guò)26S蛋白酶體途徑降解CYCLING DOF FACTOR 1（CDF1）蛋白，解除CDF1對(duì)CO轉(zhuǎn)錄的抑制作用，從而誘導(dǎo)FT表達(dá)促進(jìn)開花［16-17］。FKF1蛋白還能直接與CO結(jié)合穩(wěn)定CO蛋白［18］。此外，F(xiàn)KF1以光依賴的方式與CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1（COP1）相互作用并抑制其同源二聚化從而抑制其活性，解除COP1對(duì)CO蛋白的降解以促進(jìn)開花［19-20］。最近的研究表明，F(xiàn)KF1還能與赤霉素信號(hào)途徑關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)子DELLA蛋白互作，通過(guò)促進(jìn)DELLA蛋白降解進(jìn)而促進(jìn)植物開花［21］。

擬南芥MADS-box基因FRUITFULL（FUL）在控制擬南芥開花時(shí)間、花分生組織分化、莖生葉形態(tài)以及心皮和果實(shí)的發(fā)育中起到重要作用［22-26］。在莖尖，F(xiàn)T與bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD形成復(fù)合物，以激活FUL的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)成花轉(zhuǎn)變和啟動(dòng)花發(fā)育過(guò)程［22，27-29］。在葉片中，F(xiàn)UL也可以通過(guò)促進(jìn)FT基因轉(zhuǎn)錄加速開花［22］。FUL能夠響應(yīng)年齡途徑，受miR156調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 3（SPL3） 和 SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 9（SPL9） 直接激活FUL基因的轉(zhuǎn)錄以誘導(dǎo)開花［22，30］。FUL也能夠響應(yīng)赤霉素信號(hào)途徑，WRKY DNA-BINDING PROTEIN 12（WRKY12） 和 WRKY DNA-BINDING PROTEIN 13（WRKY13）分別是開花正調(diào)控和負(fù)調(diào)控因子，GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE（GAI）可以與WRKY12和WRKY13相互作用干擾它們對(duì)FUL基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控開花［31］。REPRESSOR OF ga1-3（RGA）與SPL15相互作用抑制SPL15對(duì)FUL基因轉(zhuǎn)錄的激活，從而調(diào)控開花［32］。

本研究采用酵母雙雜交篩選與FKF1互作的靶蛋白，鑒定到FKF1與FUL互作，并對(duì)FKF1與FUL的相互作用及兩者在開花調(diào)控中的遺傳關(guān)系進(jìn)行了探究,旨為提高對(duì)FKF1和FUL控制植物開花時(shí)間機(jī)制的理解。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型（Col）。fkf1-t（S1ALK_059480） 和 fkf1-1突 變 體， 以 及35S-FKF1-Myc過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系在我們以前的研究中已經(jīng)報(bào)道［21］。ful-8（SAIL_726_E08）突變體購(gòu)自擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）。將 35S-FKF1-Myc與 ful-8進(jìn)行雜交，獲得35S-FKF1-Myc / ful-8雙突變體。植物表達(dá)載體pCambia1300-Myc和pCambia1300-Flag，大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌AGL0為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 酵母雙雜交分析 將FKF1克隆到pGBKT7載體中獲得Bait質(zhì)粒，其他候選基因克隆到pGADT7載體中獲得Prey質(zhì)粒。將Bait和Prey質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入AH109酵母，涂布于二缺（-TL）平板上，28℃培養(yǎng)3 d左右。將5-10個(gè)單菌落重懸入100 μL的無(wú)菌水中，吸取4 μL左右重懸菌液分別點(diǎn)到二缺（-TL）和三缺（-TLH）平板上，28℃培養(yǎng)3-5 d，觀察記錄并拍照。

1.2.2 雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）分析 將FKF1和FUL分別克隆到BiFC載體pSAT1-nVenus-N和pSAT1-cCFP-N中。參考Yoo等［33］的方法，將重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光，并拍照。

1.2.3 免疫共沉淀（Co-IP）分析 將FKF1克隆到pCambia1300-Myc載體，F(xiàn)UL克隆到pCambia1300-Flag載體，獲得35S-FKF1-Myc和35S-FUL-Flag重組質(zhì)粒。參考Sparkes等［34］的方法，將兩個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化煙草葉片，黑暗培養(yǎng) 24 h 后，光下培養(yǎng)2 d，收集葉片，用Co-IP buffer（150 mmol/L NaCl；50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；5 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.5% Titon X-100；3 mmol/L DTT；1 mmol/L PMSF；1×Coctail）提取總蛋白。留10%作為 input，剩余部分加入抗Myc磁珠孵育過(guò)夜進(jìn)行免疫沉淀，磁珠用 washing buffer（150 mmol/L NaCl；50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；5 mmol/L EDTA，pH 8.0；3 mmol/L DTT）洗脫3次，然后在Input和洗脫后的磁珠中加入適量 loading buffer（0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.12 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8；5% 甘油 ；4% SDS；10%β-巰基乙醇；0.02%溴酚藍(lán)），95℃煮 10 min 左右。12 000 r/min 離心 5 min 左右，將上清液取出，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用Anti-Myc和Anti-Flag抗體進(jìn)行Western blot分析。

1.2.4 蛋白穩(wěn)定性分析 參照Yan等［21］的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析。

（1）半體內(nèi)蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將原核表達(dá)純化得到的GST-FUL蛋白與野生型Col，fkf1-1或者fkf1-t幼苗的總蛋白等比例混合，在22℃條件下孵育不同時(shí)間，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用Anti-GST抗體進(jìn)行Western blot分析。麗春紅染色作為內(nèi)標(biāo)。

（2）體內(nèi)蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將攜帶35S-FKF1-Myc或者35S-FUL-Flag載體的農(nóng)桿菌AGL0按不同比例共轉(zhuǎn)化煙草葉片。黑暗培養(yǎng)24 h 后，光下培養(yǎng)2 d，收集煙草葉片。用液氮將葉片研磨成粉末后加入適當(dāng)?shù)膌oading buffer，95℃煮 10 min 左右，12 000 r/min 離心 5 min 左右，將上清液取出，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用Anti-Myc和Anti-Flag抗體進(jìn)行Western blot分析。麗春紅染色作為內(nèi)標(biāo)。

1.2.5 mRNA水平分析 采用TRIzol 試劑（RNAiso Plus，TaKaRa） 提 取 總 RNA。 用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，Japan）試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用SYBR premix Ex Taq試劑盒，在CFX96 Real-time PCR System（Biorad）PCR儀器中進(jìn)行。內(nèi)參基因?yàn)?ACTIN2。利用 2-ΔΔct法對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.6 擬南芥開花時(shí)間統(tǒng)計(jì) 以擬南芥抽薹后，薹達(dá)到2 cm時(shí)開始統(tǒng)計(jì)兩個(gè)開花指標(biāo)：植株開花時(shí)蓮座葉的數(shù)目以及從發(fā)芽到開花的生長(zhǎng)時(shí)間。土里直播培養(yǎng)的擬南芥從種子發(fā)芽后開始計(jì)算開花時(shí)間，從培養(yǎng)基移栽到土里的植株從擬南芥幼苗移栽時(shí)間開始計(jì)算開花時(shí)間。每次統(tǒng)計(jì)的植株不少于10棵。

2 結(jié)果

2.1 FKF1的互作蛋白鑒定

FKF1蛋白在光周期開花途徑中起著重要作用，但FKF1調(diào)節(jié)開花的分子機(jī)制尚不完全清楚。為了深入研究FKF1調(diào)控開花的分子機(jī)制，我們通過(guò)AraPPINet網(wǎng)站（http://netbio.sjtu.edu.cn/），選擇了幾個(gè)可能與FKF1存在相互作用，并且參與擬南芥開花的候選蛋白如FUL，SOC1和PHYTOCHROMEINTERACTING FACTOR 3（PIF3）（表 1）。SOC1 已被認(rèn)為是促進(jìn)擬南芥開花的開花整合因子［35］。PIF3屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，是開花抑制因子［36］。FUL是花分生組織決定基因，在控制擬南芥開花時(shí)間、花分生組織分化、莖生葉形態(tài)以及心皮和果實(shí)的發(fā)育中起到重要作用。隨后，我們采用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FKF1與這3個(gè)蛋白的相互作用。結(jié)果顯示，F(xiàn)KF1與FUL和陽(yáng)性對(duì)照GIGANTEA（GI）存在相互作用，與SOC1和PIF3無(wú)相互作用（圖1）。

圖1 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)顯示FKF1與FUL和GI相互作用Fig.1 Yeast two-hybrid assay showing the interactions of FKF1 with FUL and GI

表1 FKF1候選互作蛋白Table 1 Candidate interaction proteins of FKF1

2.2 FKF1與FUL蛋白的相互作用分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)FKF1與FUL在植物體內(nèi)是否相互作用，我們采用雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和免疫共沉淀（CoIP）實(shí)驗(yàn)分析了兩者的相互作用。在BiFC實(shí)驗(yàn)中，將FKF1-nVenus與FUL-cCFP一起轉(zhuǎn)入到擬南芥原生質(zhì)體中，通過(guò)激光共聚焦觀察，在細(xì)胞核中檢測(cè)到了GFP信號(hào)（圖2-A），而陰性對(duì)照中則沒(méi)有檢測(cè)到熒光。與BiFC結(jié)果一致，在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中FKF1與FUL相互作用。當(dāng)使用抗Myc磁珠對(duì)FKF1-Myc進(jìn)行免疫沉淀時(shí)，F(xiàn)UL-Flag被共沉淀（圖2-B）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)KF1與FUL在植物細(xì)胞核內(nèi)相互作用。

圖2 雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)分析FKF1與FUL的相互作用Fig.2 BiFC and Co-IP assays showing FKF1 interaction with FUL

2.3 FKF1對(duì)FUL蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄水平的影響

FKF1是F-box蛋白參與形成SCF泛素連接酶，介導(dǎo)靶蛋白通過(guò)26S蛋白酶體途徑降解。因此，我們檢測(cè)了FKF1對(duì)FUL蛋白穩(wěn)定性的影響。首先在大腸桿菌中表達(dá)GST-FUL重組蛋白，采用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)檢測(cè)了FUL蛋白穩(wěn)定性。在該實(shí)驗(yàn)中，將從大腸桿菌中純化的GST-FUL蛋白分別與野生型植物，fkf1-1或fkf1-t突變體的總蛋白提取物混合孵育。如圖3所示，GST-FUL蛋白在野生型植物和fkf1-1或fkf1-t突變體的蛋白提取物中均降解（圖3-A），且降解速率基本一致（圖3-B）。其次，我們將FUL-Flag與不同濃度FKF1-Myc在煙草葉片中共表達(dá)，檢測(cè)FUL蛋白的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，存在FKF1-Myc或者不存在FKF1-Myc時(shí)，F(xiàn)UL-Flag蛋白穩(wěn)定性沒(méi)有明顯變化（圖3-C）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)KF1不影響FUL蛋白的穩(wěn)定性。

圖3 FKF1對(duì)FUL蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of FKF1 on FUL protein stability

隨后，我們檢測(cè)了 FKF1和FUL是否相互調(diào)節(jié)各自的 mRNA水平。將野生型Col，fkf1-1，ful-8播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，在長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)不同天數(shù)，收集幼苗地上部分，用于mRNA表達(dá)分析。qRT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)UL在花芽分化期時(shí)期開始增加，在第11-15天之間，fkf1-1突變體中FUL mRNA水平顯著低于野生型（圖4-A）。然而，F(xiàn)KF1 mRNA水平在Col和ful-8突變體中沒(méi)有顯著性差異（圖4-B）。這說(shuō)明FKF1正調(diào)節(jié)FUL的轉(zhuǎn)錄水平，然而FUL對(duì)FKF1的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著影響。

圖4 FUL mRNA的表達(dá)受FKF1調(diào)節(jié)Fig.4 FUL mRNA expression regulated by FKF1

2.4 FUL突變對(duì)FKF1過(guò)表達(dá)植物開花表型的影響

為了進(jìn)一步研究FKF1與FUL在開花調(diào)控中的遺傳學(xué)關(guān)系，我們將FKF1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物35S-FKF1-Myc與ful-8突變體雜交得到35S-FKF1-Myc / ful-8植株，觀察統(tǒng)計(jì)了雙突變體在長(zhǎng)日照條件下的開花時(shí)間。結(jié)果顯示，與野生型相比，35S-FKF1-Myc植物表現(xiàn)出提早開花的表型，ful-8突變體表現(xiàn)出開花延遲的表型（圖5-A-C），這與我們以前的報(bào)道以及前人的研究結(jié)果一致［21，37］。長(zhǎng)日照條件下，F(xiàn)UL突變可以抑制35S-FKF1-Myc植物的早開花表型，并且35S-FKF1-Myc/ful-8雙突變體與ful-8突變體表型相似（圖5-A-C），表明FUL在調(diào)節(jié)開花過(guò)程中作用于FKF1的下游。

我們檢測(cè)了ful-8突變體、35S-FKF1-Myc過(guò)表達(dá)、以及35S-FKF1-Myc / ful-8雙突變體幼苗中FT的表達(dá)。結(jié)果顯示，與野生型Col相比，F(xiàn)T的mRNA水平在ful-8突變體中顯著降低，在35S-FKF1-Myc過(guò)表達(dá)植物中則顯著增加（圖5-D），這與突變體和過(guò)表達(dá)植物的開花表型相一致。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)35S-FKF1-Myc / ful-8植物中FT的mRNA水平比35S-FKF1-Myc中的要低，與ful-8突變體中的相似（圖5-D）。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)KF1與FUL在同一條通路上，通過(guò)促進(jìn)FT的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)開花。

圖5 Col，35S-FKF1-Myc，ful-8和35S-FKF1-Myc/ful-8植物開花表型Fig.5 Flowering phenotype of Col，35S-FKF1-Myc，ful-8 and 35S-FKF1-Myc / ful-8 plants

3 討論

在合適的時(shí)間開花對(duì)大多數(shù)植物的生存和成功繁衍極為重要，植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制，通過(guò)內(nèi)源和外源信號(hào)來(lái)協(xié)調(diào)控制開花，使其在最佳時(shí)間開花。

MADS-box基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的作用。迄今為止，已經(jīng)在植物中發(fā)現(xiàn)數(shù)以百計(jì)的 MADS-box 基因。其中FUL是花分生組織決定基因，在控制擬南芥開花時(shí)間、花分生組織分化，心皮發(fā)育和果實(shí)發(fā)育中起主要作用［22-26］。與前人的報(bào)道一致［22，24，37］，ful突變體的開花時(shí)間比野生型植物晚，表明FUL正調(diào)節(jié)植物開花時(shí)間。作為開花整合因子，F(xiàn)T的轉(zhuǎn)錄受許多轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，其中一些轉(zhuǎn)錄因子起抑制作用如SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）、SCH-LAFMüTZE（SMZ）、FLOWERING LOCUS C（FLC）和 TEMPRANILLO 1（TEM1）等［38-41］，而另一些則起激活作用如CO、CRYPTOCHROME-INTERACTI-NG BASIC-HELIX-LOOP-HELIX 1（CIB1） 和 PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4（PIF4）等［12，42-43］。已有的研究表明，F(xiàn)T在光周期途徑中作用于FKF1的下游［16-17］，同時(shí)也有研究表明FUL在葉片中能通過(guò)促進(jìn)FT轉(zhuǎn)錄加速開花［22］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在ful突變體中FT轉(zhuǎn)錄水平降低，這與開花表型一致，表明 FUL正調(diào)節(jié)FT的轉(zhuǎn)錄。已知MADS結(jié)構(gòu)域蛋白可與稱為CArG-box的DNA基序結(jié)合，該基序具有共有序列 CC（A / T）6GG。CC（A / T）7G 和 C（A / T）8G也被認(rèn)為對(duì)MADS結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)合很重要［44］。FT啟動(dòng)子中存在幾種假定的CArG-box元件，這暗示FUL可能直接結(jié)合FT的啟動(dòng)子，促進(jìn)其表達(dá)和植物開花，這還需要進(jìn)一步通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

FKF1對(duì)于擬南芥的光周期開花非常重要［14-15，21，45］。在長(zhǎng)日照條件下，F(xiàn)KF1 過(guò)表達(dá)植物比野生型植物更早開花，而fkf1突變體開花比野生型植物更晚［21］。35S-FKF1-Myc / ful-8植物的開花表型與ful-8植物相似。這些結(jié)果表明FKF1與FUL在同一條通路上調(diào)節(jié)開花。并且FT在35S-FKF1-Myc /ful-8中的表達(dá)量與ful-8突變體一致，說(shuō)明FKF1和FUL共同作用于FT。基于FKF1和FUL相互作用，F(xiàn)KF1不調(diào)節(jié)FUL蛋白的穩(wěn)定性，我們提出FKF1可能通過(guò)與FUL相互作用激活FUL蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)FT的轉(zhuǎn)錄，這有待于進(jìn)一步研究。

此外，我們發(fā)現(xiàn)FKF1調(diào)節(jié)FUL的轉(zhuǎn)錄水平。由于FKF1本身不是轉(zhuǎn)錄因子，因此我們推測(cè)FKF1有可能通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用間接促進(jìn)FUL表達(dá)，這尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)酵母雙雜交，雙分子熒光互補(bǔ)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了光周期開花調(diào)控因子FKF1與轉(zhuǎn)錄因子FUL存在相互作用；基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)FKF1能夠正調(diào)控FUL的轉(zhuǎn)錄水平，但并不影響FUL蛋白的穩(wěn)定性；遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KF1與FUL能夠共同調(diào)控下游開花基因 FT的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控植物的開花時(shí)間。根據(jù)這些研究結(jié)果，我們提出FKF1與FUL在同一條信號(hào)通路上調(diào)控FT的表達(dá)和開花。