四環素雙價適配體非酶免標記傳感器

蘭欣悅 劉寧寧 朱龍佼 陳旭 褚華碩 李相陽 段諾 許文濤

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院 轉基因生物安全性評價（食品安全）重點實驗室 食品質量與安全北京實驗室，北京 100083；2. 中國農業大學營養與健康系 食品精準營養與質量控制教育部重點實驗室，北京 100083；3. 河北工程大學生命科學與食品工程學院，邯鄲 056000；4. 北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206；5. 江南大學食品學院，無錫 214122）

四環素（tetracycline，TC）由鏈霉菌生產，以抑制細菌內蛋白質生物合成的方式，發揮抗菌作用［1-2］。因其具有廣譜的抗菌效果和低成本的經濟優勢，常在畜禽、水產、蜜蜂等養殖過程中作為獸藥被使用［3-4］。然而，不當或過度使用四環素會令肉、奶等食品出現抗生素殘留，一旦被消費者攝入體內往往會令人體的肝腎功能受損，出現過敏反應等癥狀［5-6］。為有效限制四環素濫用，減少威脅人類健康及環境的問題發生，中國、美國、歐盟等都對食源性食品中四環素最大殘留量進行了嚴格的限定［7-8］。因此，針對四環素開發特異性傳感器，實現對其靈敏檢測非常必要。

近幾十年，針對四環素傳感器的開發多圍繞色譜 - 質譜［2，8-11］、酶聯免疫吸附［12］、毛細管電泳［4］、比色法［1，13-16］等技術手段展開，令檢測難以擺脫大型儀器設備，同時，抗體、酶等大分子的加入，往往會提升分析成本，延長反應時間；近幾年，依靠納米材料的加入，以電化學檢測的方式一定程度擺脫了上述缺陷，且進一步提高了檢測靈敏度［16-17］，但是反應體系依然復雜，因此，開發一種簡單、快速、靈敏、低成本的四環素傳感器是有意義和創新性的。

硫黃素T（ThT）作為常見熒光染料［18］，在2013年被報道可與G-四鏈體中G-四平面的溝槽發生鍵合作用，限制自身苯并噻唑環和二甲基芐基環在自然條件下的任意扭轉，令兩環處于同一平面，引發光開關啟動［19-20］，實現對自身熒光近1 700倍的強激發［21］，令G-四鏈體結構成為如今ThT信號輸出的主流核酸結構模型。

功能核酸適配體是通過SELEX（指數富集的配體系統進化技術）篩選出來的由十幾個寡核苷酸組成的DNA/RNA單鏈序列［22］，可通過自身折疊成特定結構與小分子、離子、蛋白質、微生物等多種靶物質發生識別結合，具有相比抗體而言更低的免疫源性和細胞毒性，同時可在體外大量合成，降低實驗成本，為信號識別和檢測創造新的機遇和突破［22-24］。2014 年，Kwon 等［25］將 76 nt的單鏈適配體剪裁為8 nt短序列，并驗證裁剪后序列具有對四環素的高結合親和力（Kd 1.067 nmol/L），實現了對四環素類藥物的比色法檢測；2015年，Mohammad等［26］將截短的8 nt序列設計進三螺旋分子開關傳感體系，將四環素檢測限降低至266 pmol/L。

因此，本文旨在以前人截短的8 nt短序列為基礎，進行理性設計，開發具G-四鏈體形成潛力的雙價四環素適配體，在提高檢測性能的基礎上［27］，實現在靶標加入前后的構象變化，最終基于ThT熒光信號響應實現對四環素的無標記傳感。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 ThT、四環素、KCl、NaCl、MgCl2、Tris粉末及甲醇溶液均購自于北京索萊寶科技有限公司；氨芐青霉素、林可霉素、氯霉素、慶大霉素及土霉素溶液為實驗室留存；實驗所用水為超純水。

1.1.2 主要設備 熒光分光光度計（G9800A），美國安捷倫科技有限公司；電子分析天平、pH計，北京六一生物科技有限公司；SCILOGEX PCR儀，美國賽洛捷克公司；sigmaD-37520高速離心機，默克公司。

1.1.3 實驗所用序列 實驗所用序列均由北京生工生物工程有限公司合成，對應詳細名稱、堿基序列組成、堿基數見表1。

表1 實驗所用序列Table 1 Sequences used in experiment

1.2 方法

1.2.1 熒光強度測定 用超純水（UP）溶解DNA序列至100 μmol/L，經PCR儀進行95℃，5 min熱解鏈，自然冷卻至室溫備用。將熱解鏈處理后的適配體序列加入pH=7.4的20 mmol/L Tris-K+緩沖液中，至終濃度為1 μmol/L，并向對應體系中加入不同濃度的四環素溶液，渦旋混勻，室溫條件孵育20 min，檢測前向體系中加入終濃度為1 μmol/L的ThT，混勻，至于熒光分光光度計中，選擇熒光測量模式，設置發射、激發狹縫寬度為10 nm，熒光分子激發波長為443 nm，在490 nm處采集最大發射光強度。

1.2.2 ThT熒光隨時間變化曲線測定 將熒光分光光度計測量程序選擇為動力學檢測模式，設置發射、激發狹縫寬度為10 nm，激發波長為443 nm，在490 nm處采集最大發射光強度，采集時間35 min，采集間隔0.02 s。

1.2.3 加標原液的制備及實際樣品檢測 將2 mL純牛奶制品用超純水稀釋至5 mL，12 000 r/min離心10 min，重復3次以分離牛乳中凝結的沉淀物，取上清液溶解四環素粉末，配置加標原液。將不同濃度的加標原液加入到終濃度含有1 μmol/L 四環素雙價適配體序列，pH=7.4的20 mmol/L Tris-K+緩沖液中，渦旋混勻，室溫條件孵育20 min，檢測前向體系中加入終濃度為1 μmol/L的ThT，混勻，將總體積100 μL的檢測樣品至于熒光分光光度計中，選擇熒光測量模式，選擇490 nm處不同四環素濃度牛奶樣本中對應ThT的熒光值，上述操作進行3次平行重復后，分析代入標準曲線計算回收濃度，獲得回收濃度與實際加標濃度之間的關系。

2 結果

2.1 實驗原理

經Kwon等［25］裁剪得到的8 nt四環素適配體為富G序列，序列組成具有構成劈裂G-四鏈體的潛力，由于G-四鏈體結構可以強激發ThT熒光，故本研究通過對序列理性設計，在不改變其自身堿基的情況下，將8 nt單序列引入重復單元，形成以16 nt雙價四環素適配體為基礎的新序列，賦予其更好的G-四鏈體形成能力。進一步，在此條件下，通過在雙價適配體基序間隔間引入適當長度的堿基單元，令序列能更易折疊形成穩定的G-四鏈體結構，從而在無靶標情況下，強激發ThT熒光，在引入靶標后，通過四環素與序列的高親和性，破壞G-四鏈體形成條件，ThT熒光不能被有效激發，實現加入靶標前后的熒光強度變化，以此為檢測信號輸出（圖1）。

圖1 四環素雙價適配體非酶免標記傳感器原理圖Fig. 1 Schematic diagram of tetracycline bivalent aptamer non-enzyme label-free sensor

2.2 雙價適配體間隔插入序列設計及激發ThT能力評估

首先，經熒光分光光度計測定了8 nt四環素適配體序列、雙價適配體序列及雙價適配體間隔插入不同堿基類型的序列之間的熒光強度。通過圖2-A可以發現，插入2G堿基的序列，相比四環素適配體序列和雙價適配體序列，顯著激發了ThT熒光；因此，在確定G為最適間隔插入堿基的基礎上，研究又對最適序列間隔插入堿基的數目進行了探究，熒光檢測結果如圖2-B所示，雙價-3G插入適配體序列相比于其他序列，熒光強度接近400，是四環素適配體序列激發ThT的近40倍，雙價適配體序列激發ThT的近14倍，故認為該序列具有最好的ThT熒光激發能力。

圖2 雙價適配體間隔插入序列激發ThT能力評估Fig. 2 Ability of bivalent aptamer spacer insert sequences to trigger ThT fluorescence

2.3 可行性驗證

檢測了序列在加入100 nmol/L四環素前后的熒光強度變化，熒光光譜如圖3所示，當體系中只有四環素或ThT時，體系幾乎無熒光信號，而在雙價-3G插入適配體的加入下，熒光信號顯著增強到近400；當向含有雙價-3G插入適配體的體系中加入四環素后，熒光信號又明顯降低至275左右，因此，加入靶標前后的ThT熒光信號差異表明該方法具有檢測四環素的可行性。

圖3 可行性驗證Fig. 3 Feasibility verification

2.4 檢測條件優化

2.4.1 測量時間優化 在與雙價-3G插入適配體序列混合后，通過動力學掃描程序監測反應體系中熒光強度實時變化，如圖4所示，ThT的熒光強度在加入體系后即時達到最高，并在5 min內迅速下降至起始熒光值的70%左右，此后，隨時間延長，熒光相比于前5 min，呈現平穩下降趨勢；至35 min，熒光值降低至起始熒光值60%左右。因此，根據ThT在反應后激發熒光隨時間延長整體呈現近指數下降趨勢，為盡可能保證ThT的最佳測量時間，本文后續的熒光測定為即時測量。

圖4 熒光強度隨反應時間變化曲線Fig. 4 Fluorescence intensity changing curve with reaction time

2.4.2 適配體序列與ThT反應體系濃度比優化 固定反應體系中雙價-3G插入適配體濃度為1 μmol/L，改變ThT濃度，設置適配體與ThT濃度呈不同梯度比的實驗組，采集各組樣本的熒光信號，結果如圖5所示，當ThT濃度從0.1 μmol/L增加到1 μmol/L時，熒光強度不斷增強，而ThT濃度的進一步增加，熒光值出現隨ThT濃度增加而降低的趨勢，說明當體系中適配體與ThT濃度比為1∶1時，ThT對序列的熒光響應達到飽和，即為檢測熒光信號的最佳比值。因此，本文后續檢測體系控制C適配體∶CThT=1∶1。

圖5 不同Captamer∶CThT 的熒光強度Fig. 5 Different fluorescence intensity of Captamer∶CThT

2.4.3 四環素孵育時間優化 通過測量100 nmol/L四環素與序列孵育不同時間的熒光強度，通過圖6結果可以看出，隨孵育時間延長，熒光值逐漸降低，并于20 min后趨于穩定，熒光信號不再有顯著的降低趨勢，說明在孵育20 min左右，四環素與適配體可完成充分的識別結合，因此選取20 min為后續實驗孵育時間。

圖6 TC與序列孵育不同時長的熒光變化Fig. 6 Fluorescence intensity changes of TC and sequence incubation for different lengths

2.4.4 反應體系及離子濃度優化 將適配體序列至于不同緩沖液體系進行反應，熒光測定結果如圖7-A所示，發現在Tris-K+緩沖液條件下，ThT熒光最強。隨后，對該緩沖液體系下K+濃度進行優化，通過圖7-B可以看出，在加入四環素前后，ThT熒光信號變化在20 mmol/L的Tris-K+溶液中最大，即該反應體系及離子濃度為最適合的雙價-3G插入適配體序列傳感緩沖體系。

圖7 反應體系及離子濃度優化Fig. 7 Optimization of reaction system and ion concentration

2.5 四環素定量檢測及標準曲線繪制

在最佳反應體系及實驗條件下，通過熒光光譜呈現的ThT熒光強度變化確定傳感器檢測性能，圖8-A所描述的即為10 nmol/L-1 μmol/L 的四環素濃度下熒光光譜響應結果，可以看到，ThT熒光強度隨四環素濃度增加而降低。選取490 nm處不加靶標條件下ThT熒光值與各四環素濃度下對應ThT值做差值，發現差值與四環素濃度的對數之間呈現良好的線性關系（圖8-B），線性方程為y=67.492 05logx+19.811 79，R2=0.995 9。 根 據 公式3σ/k（σ：空白溶液相對標準差，n=6；k：線性方程斜率），計算傳感器最低檢測限（LOD）為96 pmol/L。

圖8 TC傳感器的建立Fig. 8 Establishment of TC sensor

2.6 特異性檢測

本實驗選擇了牛奶中易出現殘留［28］的5種抗生素：氨芐青霉素、林可霉素、氯霉素、慶大霉素、土霉素，評估傳感器特異性，將490 nm處不加靶標條件下的ThT熒光值與各干擾體系ThT熒光值做差值，結果如圖9所示，可以看出，在相同實驗條件下，非靶標抗生素所產生的熒光強度變化遠遠小于靶標加入前后的數值變化程度，表明本傳感器對四環素具有較高的選擇性，即特異性良好。

圖9 特異性檢測Fig. 9 Specific detection

2.7 實際樣品檢測

為評估傳感器對真實樣品的適用性和可靠性，將傳感器應用于牛奶樣品中進行四環素檢測，進行3次平行重復，選擇490 nm處不同四環素濃度牛奶樣本中對應ThT的熒光值，分析代入標準曲線計算回收濃度，獲得回收濃度與實際加標濃度之間的關系，見表2。可以看出，該方法的回收率在103.1%到107.1%之間，即傳感器的重現性及準確度較好。此外，整個實驗可以在20 min內完成，說明本傳感器具備了在實際牛奶樣品中快速檢測四環素的能力。

3 討論

首先，本研究通過對8 nt四環素適配體序列的巧妙設計，獲得了雙價適配體間隔插入序列，分析熒光結果可知，雙價適配體模式的引入對ThT激發有促進效果，同時也印證了作者預期對8 nt四環素適配體序列有形成劈裂G-四鏈體潛力的猜測，即雙價適配體對ThT的激發源自于自身具備了一定折疊形成G-四鏈體的能力傾向。此外，2T序列的插入相比于雙價適配體序列，也一定程度增強了ThT熒光，針對這一現象，分析可能是由于T堿基賦予了序列一定的柔性［29］，更容易令兩段雙價適配體序列通過折疊形成G-四平面；而針對雙價-3G插入適配體序列對ThT的強熒光激發效果，認為這是序列在K+緩沖液體系中，折疊形成穩定G-四鏈體的直觀結果，即研究選擇在雙價適配體間隔間適當插入堿基，以更好幫助有劈裂G-四鏈體形成潛力的序列折疊形成穩定G-四鏈體結構的思路是可行且有效的。

隨后，在雙價-3G插入適配體檢測四環素的可行性驗證中，四環素加入前后ThT熒光響應變化側面印證了因靶標與適配體序列結合，破壞G-四鏈體結構，使得ThT無法插入G-四鏈體平面，熒光激發被限制，從而降低檢測熒光信號。

確定序列后，由于傳感器的熒光響應值及對靶標檢測的靈敏度與實驗體系及實驗條件密切相關，為了令傳感器獲得最佳檢測性能，在文章中分別對最適測量時間、適配體序列與ThT反應體系濃度比、四環素孵育時間、緩沖液離子體系及離子濃度進行了優化。

為了提高四環素傳感器的準確性，本實驗對ThT加入后最適熒光信號檢測時間進行了探索，發現ThT可與雙價-3G插入適配體序列快速結合，并即時產生最高的熒光激發，所獲得的ThT隨時間變化的熒光衰減曲線與Mohanty［21］和Sharmistha等［30］實驗結果相似，即在不同溶液條件下，ThT熒光衰減均非常迅速，而當K+和G-四鏈體序列加入體系后，賦予了ThT自身更好的結構剛性，使熒光衰減變緩，但總體依然呈現較為迅速的衰減趨勢；此外，因ThT衰減程度與其結構、劑量、所處微環境的極性及黏度等均相關［31-32］，而對應本實驗趨勢，可忽略ThT與序列的插入反應時間，進行即時測量。

在適配體序列與ThT反應體系濃度比優化結果中，針對C適配體∶CThT=1∶1后熒光強度下降這一現象，認為這可能是由于當ThT的濃度過高時，ThT分子傾向于形成二聚體或多聚體形式［33］，此時，因為分子結構及大小限制，將無法插入到G-四平面中，造成體系的熒光值不會增強反而降低。

由于四環素與適配體的結合程度受孵育時間影響，且在不同的結合程度會影響雙價-3G插入適配體序列形成G-四鏈體結構的穩定程度，進而影響ThT熒光信號輸出，因此，探究四環素的最佳孵育時間是非常有必要的，而在本研究體系下，經實驗確認，室溫孵育20 min即可令四環素與適配體完成充分的識別結合；在確定傳感器合適的緩沖液離子體系過程中，實驗結果表明Tris-K+緩沖液可以令3G-插入適配體序列形成G-四鏈體的趨勢最強，分析這是由于Tris-HCl溶液可以為雙價適配體序列提供合適的緩沖環境，更易實現構象自由變換，而K+又可以與G-四分體上的鳥嘌呤O6 原子保持配位，實現對G-四鏈體構象的穩定作用［21］，故以此為基礎，確認在20 mmol/L的Tris-K+緩沖液中，序列可在加入靶標前后實現最有效的構象變化，從而令ThT輸出最顯著的信號差異，實現靈敏傳感。

最終，本研究獲得的四環素傳感器具備了一定的檢測特異性和實際樣本檢測能力，且相比于毛細管電泳法［4］、酶聯免疫分析法［12］、噻唑橙無標記適配體傳感等方法［3］，具有相當甚至更高的檢測靈敏度，在免去了對大型儀器依賴的同時，減少了檢測的復雜性和時間經濟成本。

4 結論

通過對前人剪裁后8 nt 四環素適配體的理性設計，成功獲得具有G-四鏈體形成潛力的雙價適配體序列，經對檢測條件的系統優化，將ThT熒光變化作為輸出信號，實現了用于四環素的定量檢測的基于構象轉變的非酶免標記傳感器的開發。該傳感器在10 nmol/L-1 μmol/L的濃度范圍內呈現良好的線性關系，R2達0.99以上，檢測限低至96 pmol/L；同時，該法特異性強，對氨芐青霉素、林可霉素、土霉素、慶大霉素等幾種常見抗生素均無顯著非特異性信號變化，且可在20 min內可實現對牛奶樣品中四環素的快速檢測，滿足《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中對四環素最大殘留量（100 μg/kg）的檢測需求，具有一定應用于實際樣品的檢測潛力。