茶樹CsCML24的克隆及表達分析

康芮 劉春暉 陳思文 趙仁亮 周瓊瓊

（河南農業大學園藝學院，鄭州 450000）

茶 樹（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze） 起 源于我國西南地區，喜溫喜濕，主要分布在熱帶和亞熱帶地區，是我國重要的經濟作物之一，在助力脫貧攻堅和鄉村振興戰略中發揮著重要作用。近年來，由于全球氣候不穩定性的增加，茶樹在其生長周期內經常遭遇低溫、干旱等逆境的危害，造成茶葉品質與產量嚴重下降，嚴重時甚至會導致茶樹死亡，給茶產業的發展造成了極大的經濟損失［1-2］，因此，如何提高茶樹的抗逆性以抵御逆境傷害是育種工作者所關注的重點問題。

植物體內鈣離子（Ca2+）作為細胞內重要的第二信使，廣泛參與到植物的生長發育和外界刺激引起的信號轉導途徑。當植物受到刺激（包括激素處理、生物和非生物脅迫等）時，會引起細胞內外Ca2+濃度的瞬時變化，從而產生鈣信號并通過鈣靶蛋白進行信號轉導，將信息傳遞到下游響應蛋白，進而調節體內相應的生理生化反應過程，最終使植物響應外界脅迫［3-4］。其中，鈣靶蛋白對鈣信號瞬時變化的感知和解碼是鈣信號傳遞途徑中最關鍵的調控步驟。植物細胞內主要存在3種類型的鈣靶蛋白：鈣調蛋白/類鈣調蛋白（calmodulins/CaMs，CaM-like proteins/CMLs）、鈣調磷酸酶B類似蛋白（calcineurin B-like proteins，CBLs）和鈣依賴蛋白激酶（calciumdependent protein kinases，CDPKs/CPKs）［5-7］，這三大類鈣靶蛋白介導的鈣信號系統在植物應對生長發育、生物及非生物逆境中起著重要作用。

CMLs是植物特有的一類鈣靶蛋白，含有1-6個鈣離子結合的EF-hand結構域，是植物特有的一類鈣靶蛋白。CMLs的功能僅有少數植物被研究，大部分家族成員的分子調控和生物功能仍未知，但它們在植物的生長發育、病蟲害防御及外界條件刺激下發揮著重要作用［8-10］。據報道，擬南芥、水稻和番茄基因組中分別鑒別到50個［11］、32個［12］和52個［13］CML 基因，苜蓿中有 50 個 MtCMLs［14］。其中，擬南芥 AtCML8、AtCML24、AtCML37、AtCML38和AtCML39在非生物脅迫和ABA等刺激下表達量均顯著提高［15-17］；AtCML42 在抵御昆蟲時起重要作用［18］。水 稻 體 內 的 CML 基 因 OsMSR2（OsCML24）［19］、OsCML4［20］、OsDSR-1［21］和 OsCML16［22］受非生物脅迫（如低溫、干旱和鹽等）誘導。除了擬南芥和水稻，野 生 番 茄 ShCML44［23］、 杜 仲 EuCML5［24］、 蘋 果MdCML3［25］、葡萄 VaCML21［26］等均在非生物脅迫下誘導表達。杜昱林［27］以茶樹花粉為材料低溫處理篩選到CsCML21。茶樹逆境生理與分子生物學課題組前期以龍井長葉為材料克隆了5個茶樹CML基因，分析了其組織表達特異性，并進行了低溫、干旱、鹽脅迫和ABA處理，結果顯示，CML基因均有不同程度的誘導表達［28］。由此看來，CMLs的轉錄活性受到外界刺激的影響。

CML蛋白在植物抵抗低溫、干旱、高鹽和激素處理等外界刺激過程中發揮重要作用，是抗性分子育種的重要信號蛋白。然而，目前CML24的報道較少，其功能及其脅迫響應機制尚不清晰。

本研究以龍井43茶樹品種為材料，克隆獲得CsCML24，并對該基因編碼的氨基酸序列進行序列比對、理化性質和進化樹分析等。通過實時熒光定量PCR技術研究該基因在低溫、干旱、鹽脅迫和ABA處理下的響應模式，為進一步研究茶樹CsCML24對逆境脅迫的響應機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以龍井43一年生扦插苗作為試驗材料，選取長勢一致的扦插苗置于光周期16 h/8 h、光照強度為240 μmol/（m2·s）、晝夜溫度設置為 25℃/22℃、相對濕度為75%-80%的人工氣候培養箱中進行預培養，一周后進行不同組織部位取樣和逆境脅迫處理。

組織特異性分析：選取茶樹植株的不同組織（包括根、莖、嫩葉、成熟葉和花），立即用液氮速凍并置于-80℃冰箱保存備用；逆境脅迫處理：以未處理的植株作為對照（CK），進行低溫（10℃）、干旱（20%PEG 6000）、高鹽（200 mmol/L NaCl）和ABA（100 μmol/L）處理，分別在脅迫處理后0、2、4、8、12和24 h取樣（取第3片葉），每個時間設3個生物學重復，液氮速凍，-80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 茶樹總RNA提取及cDNA合成 利用RNA-prep Pure Plant Kit植物多糖多酚試劑盒（天根生化科技有限公司）提取茶樹總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，合格的RNA樣品于-80℃保存。以檢測合格的RNA為模板，使用 HiScript? III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）完成基因組DNA的去除和cDNA第一鏈的合成。

1.2.2 茶樹CsCML24的克隆 使用Primer Premier 5.0軟件設計CsCML24的CDS區全長引物，序列為CsCML24-F和CsCML24-R（表1）。以獲得的cDNA為模板，使用高保真酶Primer STAR? HS DNA Polymers進行PCR擴增。PCR體系為50 μL。PCR反應程序為 98℃ 3 min ；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃30 s，30個循環；72℃ 7 min。使用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行檢測，將目的條帶切膠回收、純化。將純化的產物與pClone007 Simple Vector克隆載體連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑選陽性克隆送至北京擎科生物科技有限公司進行測序驗證。

1.2.3 茶樹CsCML24的生物信息學分析 利用NCBI網站（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov /Blast.cgi）進行BLAST和蛋白保守域的預測。利用在線工具包ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）對CsCML24編碼的蛋白進行理化性質分析。利用在 線 軟 件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白質磷酸化位點、信號肽和跨膜結構域。在PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/form2.html）網站上預測蛋白質亞細胞定位。利用Prabi-gerland（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）和Swiss-model軟件來預測分析蛋白質的二級結構和三級結構。使用DNAMAN9.0軟件進行CsCML24氨基酸多序列比對。利用MEGA7.0軟件MEGE-X鄰近歸并法（neighbor-joining method）構建茶樹CsCML24與其他物種的系統進化樹。

1.2.4 茶樹CsCML24的表達特性分析 使用Premier 5.0軟件在CsCML24的CDS區內設計定量引物，定量引物序列為CsCML24qRT-F和CsCML24qRT-R（表1）。將反轉錄的cDNA稀釋到200 ng/μL后作為模板，以CsPTB作為內參基因（GenBank登錄號為GAAC01052498.1），進行熒光定量分析。參照Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書（諾唯贊，南京）進行操作，利用Applied Biosystems 7500FAST熒光定量儀進行qRT-PCR反應，分析CsCML24在茶樹不同組織中的表達模式，以及受到低溫、ABA、高鹽和干旱非生物脅迫后的相對表達量變化。采用2-△△CT法進行定量數據分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結果

2.1 茶樹CsCML24的克隆及序列分析

以龍井43cDNA為模板，利用特異性引物CsCML24-F和CsCML24-R進行PCR擴增和測序，克隆得到CsCML24（GenBank登錄號為MZ325391）。經測序，該基因CDS長度為480 bp，預測可編碼159個氨基酸（圖1）。

圖1 CsCML24的克隆Fig. 1 Cloning of CsCML24 gene

2.2 CsCML24編碼蛋白理化性質分析

應用在線軟件對該蛋白質進行理化性質分析，預測該蛋白質的分子式為C1386H2294N480O593S96，原子總數為4 849，分子量為38 248.08 Da，理論等電點為5.23，由159個氨基酸組成，不穩定系數為38.05，脂肪系數為22.08（表2）。用DNAMAN9.0軟件對蛋白進行親/疏水性分析，結果（圖2）顯示，該蛋白疏水性最高的位點在第155位氨基酸為1.456，親水性最高的位點在第85位氨基酸為-1.889，總平均值為負值（Gravy）-0.596，屬于穩定的親水性蛋白。CsCML24為非跨膜蛋白，SignalP-HMM在線預測CsCML24不具有信號肽，屬于非分泌蛋白。亞細胞定位預測顯示，該蛋白可能位于細胞質中。

表2 CsCML24蛋白的基本理化性質Table 2 Basic physicochemical properties of CsCML24 protein

圖2 茶樹CsCML24氨基酸序列親疏水性分析Fig. 2 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of amino acids in CsCML24 from C. sinensis

2.3 保守基序預測及蛋白結構分析

CsCML24蛋白的二級結構主要由α-螺旋構成，占49.06%，除此之外，還含有9.43%的β-轉角和6.92%的延伸片段，以及34.59%的無規則卷曲（圖3）。對CsCML24三級結構預測結果顯示，其三維結構推測與二級結構基本吻合，其中，α-螺旋占蛋白質結構的大部分區域，無規則卷曲和β-折疊分散其中（圖4）。對CsCML24進行磷酸化結構預測，結果表明，絲氨酸的磷酸化位點可能有12個，位于多肽 鏈 的 第 12、14、16、34、36、40、46、61、65、78、138和149位氨基酸，其中，14、34、46、61、65位氨基酸的預測值均在0.934以上，說明這些位點的氨基酸發生磷酸化的可能性很高。絲氨酸可能的磷酸化位點有8個，蘇氨酸可能的磷酸化位點有4個（圖5）。

圖3 茶樹CsCML24二級結構預測Fig. 3 Secondary structure prediction of CsCML24 in C.sinensis

圖4 茶樹CsCML24三維結構預測Fig. 4 3-dimension structure prediction of CsCML24 in C.sinensis

圖5 茶樹CsCML24磷酸化位點預測Fig. 5 Phosphorylation site prediction of CsCML24 in C.sinensis

2.4 CsCML24進化樹分析和氨基酸序列比對

將CsCML24的氨基酸序列在NCBI上進行同源性搜索和保守域預測，結果顯示該氨基酸屬于Ca2+結合蛋白，含有Ca2+結合位點，屬于EF-hand超家族，在16-80氨基酸位點中間含有EF-hand特異結構域（圖6）。多重序列比對結果顯示茶樹CsCML24與 獼 猴 桃（Actinidia rufa）、 陸 地 棉（Gossypium arboreum）、櫻桃（Prunus avium）等多個物種的CML具有較高相似性，相似性均在70%以上，且這些物種中的CML蛋白中均含有EF-hand結構域和Ca2+結合位點（圖7）。通過構建進化樹分析發現茶樹CsCML24與獼猴桃、煙草等親緣關系較近，與桃、李子、櫻桃等薔薇科的植物親緣關系較遠，該系統進化樹反映了CsCML24蛋白的進化規律（圖8）。

圖6 茶樹CsCML24保守結構域預測Fig. 6 Conserved domain prediction of CsCML24 in C. sinensis

圖7 CsCML24氨基酸序列與其他植物的多重序列比對Fig. 7 Multiple sequence alignment of amino acid sequences among CsCML24 and other plants

圖8 CsCML24與其他物種氨基酸序列的系統進化樹Fig. 8 Phylogenetic tree analysis of deduced amino acid sequences of CML24 from C. sinensis and other plant species

2.5 CsCML24組織表達模式分析

通過實時熒光定量PCR技術，分析CsCML24在茶樹的根、莖、嫩葉、成熟葉和花中的表達水平。結果顯示，CsCML24在成熟葉片中表達量最高，在根和花中的表達量次之，而在莖中表達量相對較低，說明CsCML24隨著茶樹的生長發育，在葉片中的表達量呈逐漸升高的趨勢（圖9）。由此推測CsCML24在葉片的發育中起到重要作用，在茶樹的根和花中也有著一定的作用。

圖9 CsCML24在茶樹不同組織部位中的表達模式Fig. 9 Expression patterns of CsCML24 in various tissues of C. sinensis plant

2.6 CsCML24對非生物脅迫的響應

茶樹CsCML24在4種脅迫下均能誘導表達，不同脅迫及不同處理時間下該基因的表達存在差異。在低溫處理下，CsCML24的相對表達量呈先升高后降低隨后又升高的趨勢，在處理4 h時其表達量達到最大值，為CK的5.68倍，在處理的8 h和12 h時，表達量也很高，分別為CK的5.37和3.76倍，24 h時表達量低于對照水平。在外源噴施ABA處理下，CsCML24表達量在2 h內明顯增加，與對照組差異顯著，隨后下降，在4 h降至最低，隨后8、12和24 h后表達量與對照組相比顯著上升，分別為CK的2.25、1.98和1.91倍，表明CsCML24的表達受到ABA信號的誘導。鹽脅迫下CsCML24表達量在4 h時表達量顯著低于對照組，在8 h時達到最大，為CK的1.37倍，之后逐漸下降。在干旱脅迫下CsCML24表達量呈現上升趨勢，在2 h時出現顯著增長，4 h表達量降至最低，之后表達量又開始上升，在24 h后與對照相比表達量呈上升趨勢（圖10）。

圖10 CsCML24在不同脅迫條件下的表達情況Fig. 10 Expression analysis of CsCML24 gene under different stress treatments

3 討論

Ca2+是植物介導各種激素和環境信號的重要信使，廣泛參與到植物的生長發育以及逆境脅迫的調控之中。類鈣調蛋白作為一類重要的鈣感受器，在Ca2+信號通路中發揮重要作用。本研究從龍井43茶樹中克隆了CsCML24，該基因cDNA全長為480 bp，編碼159個氨基酸，該蛋白為親水性的非跨膜蛋白，含有EF-hand保守結構域，序列分析顯示與其他植物的CML具有較高的相似性，表明不同物種的CML蛋白之間存在著較近的進化關系。

CML具有組織特異性。張滿倉等［29］發現馬鈴薯StCML主要在花、葉柄、芽和塊莖等中有特異表達。李迎迎等［30］在‘西伯利亞’百合中發現LiCML在花藥中表達量最高，而在根、莖、子房和花柱中的表達量極少。Ma等［28］在茶樹中克隆出CsCML16、CsCML18-1、CsCML18-2、CsCML38和 CsCML42五個CML基因，這些基因在茶樹的各個部位中也都有表達。本研究中CsCML24在茶樹不同組織部位中的表達水平差異較大，在成熟葉片中表達量最大，其次是根，而在莖中的表達量最低，說明基因的轉錄水平在不同組織中存在差異。

研究表明植物CML基因的表達受非生物脅迫的誘導。如AtCML24能夠在擬南芥中響應高溫、低溫、氧脅迫及ABA的誘導中表達，參與到擬南芥的非生物脅迫響應中［31］。OsCML16在低溫脅迫下表達量顯著提高，可能參與到水稻冷脅迫響應中［22］。在番茄中，過表達SlCML44的番茄植株對寒冷、干旱和鹽脅迫表現出更強的耐受性，并且具有更高的發芽和更好的幼苗生長，SlCML16和SlCML51也在冷脅迫下被誘導，推測其可能也參與到番茄對冷脅迫的響應中［23］。申清湄［32］對苜蓿低溫脅迫下MfCML24表達分析的研究結果顯示，MfCML24在低溫逆境表達量變化為“升-降-升”3個階段。在本研究中，低溫和干旱脅迫下CsCML24表達量均明顯上調，與申清湄的研究結果相似，說明CsCML24的表達受低溫和干旱脅迫的誘導，CsCML24可能參與植物響應低溫、干旱脅迫的調控；在鹽脅迫下，CsCML24的表達呈現先升高后降低的趨勢，而且相較低溫、干旱和ABA處理下，該基因的表達量整體比較低，說明該基因對鹽脅迫不敏感，不同物種的CML基因表達模式可能存在差異；CsCML24在ABA誘導的表達量呈上升-下降-上升的狀態，說明其在ABA依賴型調控途徑中可能起到重要作用。其中CsCML24在非生物脅迫處理下，2 h的時候表達量明顯增加，而在4 h表達量下降，之后又上升，這種變化可能與植物的應激反應有關［33-35］，猜測基因可能在植物應對非生物脅迫中存在兩個調控途徑，在剛遭遇非生物脅迫時，植物感應到各種外源信號的時候很敏感，引起植物的應激反應，從而引起相關基因的快速上調表達，之后植物開始緩慢適應逆境環境，啟動另一種抗逆境脅迫途徑，來讓植株緩慢適應環境，盡可能減少環境對植株的損傷，這與劉偉等的［24］研究結果相一致，杜仲EuCML5的表達量在鹽處理4 h時也是下降的。綜上，本研究通過克隆龍井43茶樹CsCML24并研究其在不同組織中的表達差異，及不同非生物脅迫處理下的表達模式，結果表明，CsCML24在多種脅迫下均有響應，可能參與到多種植物對脅迫的調控作用，這為今后研究該基因功能及其逆境脅迫下的作用機理提供理論基礎。

4 結論

克隆獲得一個類鈣調蛋白基因CsCML24，其含有典型的EF-hand保守結構域，能與Ca2+結合發揮鈣調蛋白的功能。CsCML24在茶樹各組織中均表達，在成熟葉的表達量顯著高于其他組織，莖中表達量較低。低溫、干旱、高鹽和ABA均能誘導CsCML24的表達，且在不同脅迫下表達差異顯著，推測該基因可能在茶樹響應和抵抗非生物脅迫的過程中發揮作用。