茉莉花萜類合成酶基因的轉錄組鑒定及響應外源激素的表達研究

洪雅萍 陳雪津 王鵬杰 谷夢雅 高婷 葉乃興

（福建農林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室，福州 350002）

茉莉花［Jasminum sambac（L.）Ait］屬于木犀科（Oleaceae）素馨屬植物，是一種典型的氣質花，其香氣隨著花朵的盛開而逐漸釋放［1］。香氣是評價茉莉花品質優劣的重要指標之一，萜類化合物是其香氣的重要組成部分，根據萜類化合物中異戊二烯（isoprene，C5）的單元數量的不同，可分為單萜（monoterpene，C10）、倍半萜（sesquiterpene，C15）、二 萜（diterpene，C20）、 三 萜（triterpenes，C30）、四萜（tetraterpenes，C40）及多萜（polyterpenes）等［2］。植物花香中最常見的單萜和倍半萜是具有揮發性或香氣物質的小分子化合物，如：檸檬烯、芳樟醇、月桂烯、石竹烯、法尼烯等［3］。萜類化合物是茉莉花香氣中占比最大的一類揮發性化合物，含有芳樟醇、法尼烯、橙花叔醇和石竹烯等［4］。

萜類合成酶（terpenoid synthase，TPS）是萜類化合物合成中下游的關鍵酶，萜類合成酶種類和功能的多樣性構成了復雜的TPS基因家族及多樣的萜類化合物。萜類化合物可以通過位于細胞質的甲羥戊酸（MVA）途徑和位于質體的甲基赤蘚糖磷酸（MEP）途徑合成，萜類合成酶利用兩條途徑生成的異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）作為合成前體，從而合成多種多樣的萜類化合物［3］。根據萜類合成酶氨基酸序列40%同源性作為區分標準，可將其劃分為7個亞家族為TPS-a～TPS-g，被子植物中的萜類合成酶主要分布于TPS-a、TPS-b 及 TPS-g，TPS-c是最原始的亞家族［5］；TPS-g為最后發現的亞家族［6］；TPS-e及TPS-f合稱為 TPS-e/f。近年來，已在擬南芥［7］、番茄［8］、茶樹［9］、水稻［10］等物種中對TPS基因家族進行了系統的研究，在姜花［11］、茶樹［12］和艾草［13］等物種中克隆得到TPS基因，此外，前期課題組也通過克隆得到茉莉花TPS基因［14］。萜類合成酶在植物組織中存在特異表達，陳雪津等［15］在茶樹中篩選出16個萜類合成代表基因分別在頂芽和嫩葉中高表達，程甜等［16］在中?？Х萒PS家族中發現20個基因僅在特定組織中表達。植物TPS基因的表達會受到外源激素的影響，茉莉花JsNES/LINS基因會受多種外源激素不同程度的誘導［17］；孟崔穎［18］使用5種不同的外源激素處理丹參植株，發現其中SA會使4個丹參TPS基因顯著下調表達；姜黃C-HMGR與C-FPS基因的表達量均可被IAA、ABA、SA、GA誘導上調表達［19］。迄今為止，對茉莉花TPS基因家族系統的鑒定和表達模式分析未見報道。

為了更加全面地了解茉莉花TPS基因家族的信息，本研究利用前期課題組的轉錄組數據，從中篩選出茉莉花TPS基因序列，利用生物信息學方法，對茉莉花TPS基因家族進行了系統的鑒定及分析；采用實時熒光定量技術，探究該家族基因在茉莉花不同組織中及不同激素處理下的表達模式。為今后探索茉莉花TPS基因家族的功能及外源激素脅迫下的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雙瓣茉莉花取自福建農林大學茉莉花種質資源圃。在自然生長狀態下，取茉莉花的根、莖、葉、花蕾和花瓣等不同組織，作為茉莉花TPS家族基因組織表達分析的材料。采用100 μmol/L的IAA（生長素）、30 μmol/L 的 GA（赤霉素）、1 000 μmol/L 的SA（水楊酸）和100 μmol/L的 MeJA（茉莉酸甲酯）等不同激素分別處理茉莉花植株，具體濃度設置參照前人［17，20］的方法 ；取處理 0、2、4、6、9和 12 h后的茉莉花瓣，作為茉莉花TPS家族對不同激素表達響應研究的材料。以上材料設3次重復，用錫箔紙包裹、液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱用于后續的RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 茉莉花TPS基因家族成員的鑒定 本研究基于課題組前期獲得的茉莉花轉錄組測序數據［21］，對茉莉花中的萜類合成酶基因進行鑒定。從Pfam（http://pfam.xfam.org）數據庫下載含有TPS基因家族的特征結構域PF01397和PF03936的隱馬爾可夫模型，以此作為種子序列進行比對，并利用HMMER軟件及 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）網站鑒定，確認候選序列是否具有完整的TPS特征結構域，即Terpene_synthase（PF01397）和Terpene_synthase_C（PF03936），經校對后留下同時具有兩個特征結構域的序列。在ExPASy（https://www.expasy.org）網站對茉莉花TPS蛋白進行理化性質分析。利用在線網站WOLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）進行亞細胞定位預測。在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）網站對茉莉花TPS基因進行功能預測。

1.2.2 茉莉花TPS基因家族系統進化樹構建及序列比對分析 根據擬南芥、番茄和茶樹關于TPS基因的相關文獻［7-9］整理基因登錄號，隨后從TAIR（https://www.arabidopsis.org/）、SOL（http://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/genome）和TPIA（http://tpia.teaplant.org/）數據庫下載對應序列，均保留原文獻命名方式；從NCBI蛋白數據庫下載油橄欖和桂花的TPS基因家族成員序列。將擬南芥、番茄、茶樹、油橄欖和桂花的蛋白序列與茉莉花TPS蛋白序列共同使用MEGA7.0軟件，以鄰接法構建系統進化樹，Bootstrap值設置為1 000［22］。為預測茉莉花TPS家族結構，采用DNAMAN7.0軟件和Web Logo（http://weblogo.berkeley. edu/logo.cgi）在線軟件分析茉莉花TPS家族的保守序列。

1.2.3 茉莉花TPS保守基序分析 茉莉花TPS蛋白序列利用MEME在線軟件（http://meme-suit.org/tools/meme）對茉莉花TPS蛋白序列進行保守基序預測，基序最大的數目設置為13，其余為默認［23］。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 分別提取上述處理的茉莉花瓣的總RNA，RNA用逆轉錄試劑盒（TaKaRa）反轉錄成cDNA作為模板。茉莉花Actin基因作為內參，以茉莉花TPS家族基因的CDS序列在Primer3 Plus在線網站（http://www.primer3plus.com/）進行引物設計（表1）。通過Bio-Rad的CFX96 Touch熒光定量PCR儀進行qRT-PCR反應，反應體系使用Transstart? Tip Green qPCR superMix試劑盒的方法，程序為94℃，30 s；94℃，5 s；60℃，30 s，40個循環。利用2-△△Ct算法計算基因的相對表達量。不同組織的相對表達量進行歸一化處理并使用TBtools軟件制作熱圖，使用SPSS17.0軟件進行差異顯著性分析（P＜0.05），然后在Prism8軟件中制作柱狀圖。

2 結果

2.1 JsTPS基因家族的鑒定及序列分析

本研究基于課題組前期獲得的茉莉花轉錄組測序數據，于Pfam數據庫中下載PF01397和PF03936的隱馬爾可夫模型作為種子序列進行比對，并通過HAMMER和SMART網站進行鑒定，最終獲得8條同時具有PF01397和PF03936結構域的蛋白序列，分別命名為JsTPS1-JsTPS8（表2）。通過蛋白理化性質分析發現，JsTPS家族成員的蛋白長度在163-844個氨基酸范圍內；分子量在19 103.6-96 887.4 kD之間；等電點在5.18-6.09之間，為酸性蛋白；茉莉花TPS成員平均親水性均為負值，屬于疏水性蛋白；亞細胞定位分析結果表明，JsTPS1、JsTPS3、JsTPS4和JsTPS6定位于葉綠體，JsTPS2、JsTPS5和JsTPS7定位于細胞質，JsTPS8未預測出。在NCBI對茉莉花JsTPS基因進行手動功能注釋，依此推測JsTPS1、JsTPS5和JsTPS7分別是大根香葉烯D合酶、α-法尼烯合酶和（E，E）-香葉基芳樟醇合酶。

表2 茉莉花JsTPS基因家族的序列特征Table 2 Sequence characteristics of JsTPS genes in J. sambac

2.2 JsTPS家族系統進化樹及序列比對分析

為了探索茉莉花TPS家族的分子系統進化關系，將茉莉花與擬南芥、番茄、茶樹、油橄欖和桂花的TPS家族蛋白序列構建系統進化樹（圖1）。本研究中TPS家族可分為5個亞家族。茉莉花TPS家族 分 布 在 TPS-a、TPS-b、TPS-e/f和 TPS-g這 4個亞家族，TPS-c亞家族中不含茉莉花TPS家族成員。其中TPS-b亞家族是茉莉花TPS家族最大的亞家 族， 包 含 JsTPS2、JsTPS3、JsTPS4和 JsTPS5；TPS-a、TPS-e/f和 TPS-g分別包含 JsTPS1、JsTPS7和JsTPS6。

圖1 茉莉花與其他植物TPS蛋白的系統進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the TPS proteins in the J. sambac and other plants

對茉莉花TPS蛋白序列的進行序列比對及保守性logo分析（圖2），結果發現僅JsTPS1、JsTPS2和JsTPS5含有完整的位于N端的雙精氨酸殘基RRX8W序 列，JsTPS3、JsTPS4、JsTPS6和JsTPS7中RRX8W序列發生了不同程度的變化，JsTPS8中沒有發現該序列，說明RRX8W序列的保守性較差。RXR序列在JsTPS6和JsTPS7中發生了變化，表明其保守性也不高。除JsTPS8外，其余茉莉花TPS家族成員中均發現位于C端的富含天冬氨酸殘基的DDXXD和NSE/DTE保守序列，說明這兩個序列的保守性較高。

圖2 茉莉花TPS中RRX8W、RXR、DDXXD及NSE/DTE保守序列的比對Fig. 2 Alignment of the RRX8W，RXR，DDXXD and NSE/DTE conserved sequence among J. sambac TPS

2.3 JsTPS家族的保守基序分析

使用MEME在線網站對茉莉花TPS蛋白進行保守基序預測，檢測到13個保守基序（圖3）。TPS-b中的JsTPS2、JsTPS3、JsTPS4和JsTPS5包含全部基序，但JsTPS8只含基序2、7、8和9；TPS-a中的JsTPS1僅缺少基序12；TPS-g中的JsTPS6僅缺少基序4；TPS-e/f中JsTPS7缺少5個基序，分別是基序2、3、5、10和12。同時發現基序7、8、9在茉莉花TPS家族中高度保守，存在于所有茉莉花TPS家族成員中，提示這3個基序在茉莉花TPS家族中具有重要作用。此外，亞家族中的保守基序不盡相同，說明茉莉花TPS家族成員在進化和功能上的差異可能與亞家族的差異有關。

圖3 茉莉花TPS家族保守基序分析Fig. 3 Conservative motif analysis of TPS family in J. sambac

2.4 JsTPS基因在不同組織下的表達模式

采用實時熒光定量PCR技術檢測茉莉花植株的根、莖、葉、花蕾及成熟花等不同組織中茉莉花TPS家族成員的相對表達量（圖4），結果表明，JsTPS4和JsTPS8不表達，其余6個茉莉花TPS家族成員均檢測到表達。茉莉花TPS家族中JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5和JsTPS7在花瓣中表達均高于其他組織，JsTPS6在花蕾中表達較高，表明茉莉花TPS可能在茉莉花的開放時具有重要作用?？傮w上，茉莉花TPS家族基因在茉莉花花瓣上表達量極高，在根、莖、葉和花蕾中低表達。

圖4 茉莉花JsTPS家族在不同組織的表達譜Fig.4 Expression patterns of J. sambac JsTPS family in different tissues

2.5 JsTPS基因家族在4種激素處理下的表達模式

采用實時熒光定量PCR技術分別測定噴施IAA、GA、SA和MeJA后不同時間（0、2、4、6、9和12 h）茉莉花TPS家族成員的相對表達量（圖5）。結果表明，JsTPS4和JsTPS8不表達，其余6個茉莉花TPS成員均檢測到表達。在IAA處理中，6個茉莉花TPS基因均被誘導上調表達，峰值分別約為0 h的5、7、84、50、3和181倍；其中JsTPS7的表達量最高并于6 h出現峰值，與JsTPS1、JsTPS5、JsTPS6和JsTPS7都呈先上升后下降趨勢；此外，JsTPS2無明顯表達趨勢，JsTPS3呈上調表達；說明IAA對茉莉花TPS的誘導作用不同。在GA處理下，JsTPS3的表達量最大，于12 h達到峰值約為0 h的106倍；JsTPS1和JsTPS2的表達量呈下調趨勢，表明GA可能會抑制它們的表達。在SA處理下，JsTPS1、JsTPS2及JsTPS6的表達量呈現下調趨勢，說明這些基因可能受到SA的脅迫作用；JsTPS3表達量最高，于9 h時達到峰值約為0 h的9倍。在MeJA處理下，6個茉莉花TPS基因均可被顯著誘導上調表達，最大值出現在4-9 h間，峰值分別約為0 h的11、52、35、190、18及74倍，其中JsTPS5基因的表達量最高?？傮w上，MeJA可顯著誘導茉莉花TPS家族成員的表達，IAA次之，GA和SA會抑制部分茉莉花TPS基因的表達。

圖5 茉莉花JsTPS在不同激素處理下的表達模式Fig.5 Expression analysis of JsTPS under different treatments of IAA，GA，SA and MeJA

3 討論

萜類化合物作為植物香氣中重要的揮發性化合物之一，距今已發現5萬多種萜類化合物［1］，萜類合成酶是參與萜類化合物合成的關鍵酶。本研究通過茉莉花轉錄組數據并利用生物信息學方法，對茉莉花萜類合成酶基因進行了系統的鑒定，得到8條同時具有Terpene_synthase和Terpene_synthase_C特征結構域的茉莉花TPS基因。通過構建系統進化樹，發現茉莉花TPS家族成員可分為4個亞家族，分別為 TPS-a、TPS-b、TPS-e/f及 TPS-g，與毛竹 TPS家族的分類結果一致［24］；TPS-a亞家族中茶樹TPS基因均預測是大根香葉烯D合酶［9］，JsTPS1和它們處在一個亞家族，推測同為大根香葉烯D合酶，且與在NCBI上的預測結果一致。此外，番茄的TPS37和TPS39的功能已知，編碼產物均為芳樟醇或橙花叔醇［8］，JsTPS6與這2個基因同源性高，據此推測JsTPS6的功能與TPS37或TPS39的功能相似。序列比對分析發現茉莉花TPS家族含有4段富有功能的保守序列，RRX8W和RXR序列的保守性較差，DDXXD及NSE/DTE序列的保守性較高；其中雙精氨酸殘基RRX8W序列的缺失會導致單萜合酶無法產生環狀單帖產物［6］；DDXXD序列被認為是結合二價金屬離子的活性位點，在引導二價異戊二烯基二磷酸底物的催化中起重要作用［25］。

植物的萜類合成酶基因在組織中存在特異性表達，例如毛竹TPS基因家族中PeTPS2的表達量在早、晚花期中最高，PeTPS1的表達量在葉中最高［24］；棉花中GhTPS1和GhTPS3在果皮中的表達量最高，在子葉中最低，在花瓣中卻沒有檢測到［26］。俞瀅等［14］利用熒光定量 PCR 技術檢測JsTPS在茉莉花開放過程中的表達量變化，發現在花朵未開放時即花蕾時期JsTPS表達量最低，在半開放時最高，并推測JsTPS基因的表達量與茉莉花香氣形成有關。本研究中 JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5及 JsTPS7在花瓣中高表達，總體上在根、莖、葉和花蕾中低表達，與俞瀅等［14］的結果大體一致，推測JsTPS家族基因對茉莉花香氣的形成有重要作用，同時也為茉莉花為“氣質花”提供基因角度上的支持。

生長素、赤霉素、水楊酸及茉莉酸甲酯等外源激素可單獨或通過協同作用參與調控植物的生長發育過程［27］，茉莉酸甲酯還可以影響植物芳香化合物的合成［28-30］。崔孟穎［18］使用適宜濃度的5種外源激素處理丹參4 h，發現不同激素處理對4個丹參TPS基因誘導程度不同，ABA可以使YL-1的表達量上調，ETH和ABA會使YL-4、YL-5及YL-6上調表達，SA使YL-4、YL-5及YL-6下調表達。陳笛等［17］使用不同激素處理茉莉花植株，發現IAA、GA、MeJA和ABA等激素可不同程度誘導JsNEL/LINS基因的表達。本研究中利用IAA、GA、SA及MeJA等不同激素處理茉莉花植株，發現4種激素均可誘導 JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5、JsTPS6和JsTPS7不同程度的表達，誘導作用從大到小分別是 MeJA＞IAA＞GA＞SA，GA和 SA會抑制部分茉莉花TPS基因表達，IAA和MeJA可顯著誘導茉莉花TPS基因的上調表達，表明外源激素可誘導茉莉花TPS基因的表達，從而催化萜類化合物的合成。此外，JsTPS3在各激素處理下表達量都較高，暗示著JsTPS3可能可響應大部分激素的誘導；茉莉酸甲酯會顯著誘導植物中的萜類化合物的產生和積累，王力［31］使用茉莉酸甲酯處理茶葉鮮葉，發現茉莉酸甲酯會使茶鮮葉中萜類化合物相對含量的提高，如α-畢澄茄油烯、石竹烯和α-法尼烯等香氣成分。本研究中6個茉莉花TPS基因均能被MeJA顯著誘導上調表達，表明MeJA在誘導茉莉花TPS家族成員合成萜類化合物中作用顯著。

4 結論

本研究基于茉莉花轉錄組數據對茉莉花TPS基因進行鑒定，得到8條同時具有兩個特征結構域的茉莉花TPS基因，茉莉花TPS家族基因主要在花瓣中高表達且與茉莉花香氣形成關系密切，還能夠被IAA和MeJA誘導上調表達，GA和SA可能會抑制部分茉莉花TPS基因的表達。