中藥渣堆肥中解磷細菌的篩選、鑒定及其拮抗作用

胡珊 梁衛驅 黃皓 徐匆 羅華建 胡楚維 黃曉彥 陳仕麗

（東莞市農業科學研究中心，東莞 523000）

磷是植物生長的必需元素之一，它參與了植物生長發育多種生理、生化過程，對提高農作物的產量和品質有重要作用［1-2］。我國土壤中植物可吸收利用的有效磷含量匱乏，絕大多數的磷都以植物極難吸收的難溶礦物態存在。目前，農業生產中通過施用磷肥補充磷元素［3］。研究表明，中國磷肥的當季利用率僅有 5%-25%，大量的磷肥殘留在土壤中被土壤礦物質吸附成為難溶性磷酸鹽，不能被植物吸收利用［4-5］。長期施用化學磷肥還易造成磷素資源耗竭、環境污染、土壤板結等問題，不利于農業的可持續發展［6］。因此，如何轉化土壤中的無效磷，提高土壤有效磷的含量，是解決土壤中磷素營養缺乏的有效途徑。

解磷微生物（phosphate-solubilizing microorganisms，PSMs）是指能將無效態磷轉化為植物可吸收態磷的微生物，包括解磷細菌、真菌和放線菌［7］。除了解磷作用，解磷微生物對植物可能還具有促生作用，能改善因大量施肥而造成的土壤退化等環境問題。因此，解磷微生物的篩選和應用成為緩解土壤缺磷問題的有效途徑。近年來，在土壤、紅樹林和植物根際等環境中開展解磷微生物的研究及應用已成為國內外土壤肥料及植物營養研究的熱點之一［8-11］。中藥植物以其特殊的藥理亦成為解磷菌篩選的研究對象，目前已有研究主要集中在從地黃［12］、當歸［13］、潞黨參［14］及連翹［15］等藥用植物根際分離獲得解磷菌株，并對其固氮、解鉀、產生生長激素和抑病機理等方面進行了探索。

中成藥生產過程中產生的中藥渣包含植物纖維、脂類、蛋白質、多糖、黃酮、生物堿、萜類以及氮、磷和鉀等物質，現主要用于制備生物有機肥［16-17］。魯耀雄等［18］研究中藥渣堆肥過程微生物菌群變化發現，堆肥過程中細菌數量多于放線菌和真菌的數量。王明歡等［19］從中藥藥渣中篩選出1株固氮菌、2株解磷菌和3株解鉀菌，并研究相應固氮、解磷及解鉀能力。中藥渣堆肥有殘留的藥理作用和豐富的微生物，而有拮抗作用的解磷菌研究甚少。本研究擬從中藥渣堆肥中分離篩選解磷細菌，并對其進行鑒定和拮抗作用的試驗，旨在為開發高效、安全微生物菌肥篩選優良菌株，助力生態農業可持續發展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 篩選材料 樣品取自東莞市農業科學中心試驗基地室外已堆放2個月中藥渣。

1.1.2 主要設備 電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；YXQ-LS-75G 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ZHWY-211B恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；正置熒光顯微鏡：奧林巴斯 Olympus；LRH-250生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；UV-1800全波長掃描分光光度計：日本島津公司；TSQ Quantum Ultra & Access MAX液相色譜質譜聯用儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.1.3 培養基 有機磷細菌培養基（含瓊脂）、硅酸鹽培養基、酪蛋白瓊脂培養基、阿須貝無氮培養基、CAS檢測培養基：青島高科技公園海博生物技術有限公司；營養肉湯：北京陸橋技術股份有限公司；馬鈴薯瓊脂培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；蒙吉娜卵磷脂培養基：蔗糖（葡萄糖）10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.3 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，CaCO35.0 g，卵磷脂1.0 g（卵磷脂用時先溶于75%乙醇中），去離子水1 L，pH 7.2-7.4；KB培養基：蛋白胨10 g，甘油10 mL，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，離子水 1 L，pH 7.0。

1.1.4 供試植物病原菌 水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.）、花生褐斑病菌（Cercospora arachidicola Hori）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum Went.）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和冬瓜根腐病菌（Fusarium solani）由華南農業大學植物病理系提供。

1.2 方法

1.2.1 解磷細菌的篩選 中藥渣室外堆肥2個月后，在堆肥處采用三點取樣法取藥渣混合為1份，用無菌袋密封帶回實驗室。

在無菌條件下，稱取10 g藥渣溶于90 mL的無菌水在120 r/min的振動篩上搖動1 h，并梯度稀釋成10-3、10-4和10-5倍的藥渣懸液，每個稀釋度各取100 μL均勻涂布于解磷細菌培養基平板上，36℃倒置培養3 d，觀察有無溶磷圈。挑選溶磷圈較大的菌落進行平板劃線純化，反復進行3次，同時用顯微鏡觀察菌落純度，直至獲得純培養。最后將所獲得的純培養菌株轉入終濃度為30%的甘油中密封保存于-20℃冰箱。

1.2.2 解磷細菌的復篩

1.2.2.1 采用溶磷圈法測定 解磷細菌在固體培養基上的解磷作用。將待測菌株點接于有機磷固體培養基，3次重復，36℃的恒溫箱中培養3 d，根據透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（D/d）初步確定菌株解磷能力的強弱。

1.2.2.2 采用磷鉬藍比色法測定 解磷細菌在液體培養基中的解磷作用。將篩選菌株接種于20 mL高溫滅菌的營養肉湯培養基中于36℃，130 r/min下活化培養1 d，作為種子液。將種子液按1.5%（體積比）的接種量轉接至100 mL高溫滅菌的蒙金娜卵磷脂培養基中，以不接任何菌液的發酵培養基為空白對照組，每個處理設3重復，于36℃，130 r/min下培養5 d。5 d后取50 mL發酵液4℃，9 000 r/min，離心15 min后取上清液，用磷鉬藍比色法測定發酵液中的有效含磷量，實驗組和對照組可溶性磷含量的差值即為待測菌株解磷量。

1.2.3 解磷細菌的鑒定

1.2.3.1 形態學觀察 參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第九版）［20］觀察解磷細菌在營養瓊脂（NA）培養基表面生長菌落的形態、顏色等；挑取幼齡培養物，涂片、革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態、大小、革蘭氏染色反應，以及芽孢的有無、形態和著生位置等。

1.2.3.2 API系統鑒定 使用法國梅里埃公司生產的API 20NE和API 20E系統對菌株進行生理生化鑒定。

1.2.3.3 16S rDNA鑒定 提取細菌的基因組DNA后，采用細菌16S rDNA的通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R ：5′ -TACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′）進行PCR擴增。PCR 產物經凝膠電泳檢測后送至上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。將測序結果提交GenBank進行BLAST比對，并選取同屬內近緣種的16S rDNA基因序列進行同源性分析，利用MEGA11 ALPHA 構建系統發育進化樹。

1.2.4 解磷細菌促生拮抗因子測定［21-22］

1.2.4.1 解鉀指標的測定 解磷細菌三區劃線到硅酸鹽培養基中，36℃培養72 h，觀察是否有光滑透明油滴狀菌落。

1.2.4.2 固氮能力測定 將細菌接種于阿須貝無氮培養基平板上，以無菌水為對照，3次重復，平板置于36℃培養箱培養，第7天平板上有菌落者為陽性。

1.2.4.3 菌株產吲哚乙酸（IAA）的檢測 以Salkowski法測定產吲哚乙酸的能力。將細菌接種于含100 mg/L色氨酸的LB液體培養基培養3 d后，取2 mL發酵液4℃，9 000 r/min，離心15 min后取上清液，每1 mL上清液加2 mL Salkowski試劑，室溫條件下暗處顯色1 h，測定OD530值。以空白培養基作對照，并以IAA標準品對應的OD530值繪制標準曲線，計算發酵液中的IAA含量。

1.2.4.4 產生嗜鐵素能力的檢測 將細菌點接于CAS檢測培養基平板上，置于36℃培養7 d，觀察菌落周圍是否會出現明顯的橙色鐵載體暈圈，若產生暈圈，則表明細菌能分泌鐵載體的。

1.2.4.5 蛋白酶檢測 將細菌單菌落接種到酪蛋白培養基平板上，36℃培養2 d，觀察是否產生透明圈，若產生透明圈，則表明有蛋白酶產生。

1.2.5 解磷細菌藥敏實驗 采用K-B紙片擴散法對解磷細菌進行藥敏實驗。將篩選細菌接種于20 mL高溫滅菌的營養肉湯培養基中于36℃，130 r/min下活化培養24 h，均勻涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上。將浸有各種抗生素溶液的藥敏紙片均勻分布粘貼在培養基上，36℃培養24 h后，測定抑菌圈直徑。根據NCCLS提供的標準判斷菌株對藥物的敏感程度。

1.2.6 解磷細菌對植物真菌病害的拮抗作用

1.2.6.1 解磷細菌的發酵液和無菌濾液制備 將細菌單菌落接種至LB培養基中，36℃、130 r/min振蕩培養 24 h，調整菌液OD600至1.0作為種子液。將種子液按1.5%（體積比）的接種量轉接至LB培養基中，28℃、130 r/min振蕩培養5 d后即得發酵液。將發酵液于4℃，9 000 r/min離心15 min，取上清液用0.22 μm無菌濾膜過濾，獲得無菌濾液。

1.2.6.2 發酵液抑菌譜測定 按榮良燕等［23］的方法，采用平板對峙法測定細菌與病原真菌的拮抗作用。將真菌與細菌同時接種在PDA平板上，平板中心接種直徑為6 mm的真菌菌餅，距中心2 cm處等距離三點接種YP5發酵液（用加液槍將20 μL菌液垂直滴在培養基上），以不接種細菌的真菌平板為對照，每種組合3個重復。28℃培養，觀察生長情況，在對照菌落長滿平板時，測量真菌距細菌遠端和近端的半徑，按式（1）計算細菌對病原真菌的抑制率。抑制率越高，細菌對真菌的抑制作用越強。

無菌濾液的抑菌率測定［24］：帶毒培養基法。將無菌濾液按體積濃度5%與50℃左右的PDA培養基混合倒平板，不加無菌濾液的PDA作為對照。在混合培養基中央放置直徑6 mm的真菌菌餅，每個處理3個重復。28℃培養，觀察生長情況，在對照菌落長滿平板時，按式（1）計算測量菌落直徑并計算抑制率。

1.2.7 解磷細菌產申嗪霉素的定量分析鑒定

1.2.7.1 發酵培養條件［25-26］從LB平板上挑取細菌單菌落接種至20 mL LB液體培養基36℃，130 r/min中振蕩培養24 h，調整菌液OD600至1.0作為種子液。按1.5%的接種量將種子液分別接種至KB培養基和黃豆浸粉培養基中，分別在36和28℃，130 r/min恒溫搖床中培養120 h。將發酵液于4℃，9 000 r/min離心15 min，取上清液。

1.2.7.2 申嗪霉素檢測［27］將YP5發酵的上清液用甲醇稀釋，離心，取上清液，濾膜過濾后進樣分析。分析參數如下：流動相為0.1%甲酸水（A），甲醇（B）；流速為0.4 mL/min；進樣量為10 μL；色譜柱為 Hypersil-Gold-C18（100×2.1 mm，5 μm）；梯 度洗脫程序為0-2 min，95% A；2 min-6 min，95%-2% A；6 min-8 min，2% A；8.1 min-10 min，2%-95% A。用甲醇溶解申嗪霉素標準品配置標準溶液，繪制標準曲線。

1.2.8 數據處理 采用統計軟件SPSS17.0及Microsoft Excel 2007對數據進行分析，圖表中數據為平均值±標準差。采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以最小顯著性差異法（LSD）多重比較檢驗不同處理之間的差異顯著性（α=0.05）。

2 結果

2.1 解磷細菌的篩選及解磷能力測定

利用有機磷細菌培養基對堆肥2個月中藥渣進行解磷細菌篩選，挑取其中5株生長速度快，在培養基上具有較大溶磷圈的細菌進行劃線純化后分別命名為 YP1、YP2、YP3、YP4和 YP5。通過溶磷圈法測定各菌株的解磷作用。測量各菌株透明圈直徑的大小，試驗結果如表1所示，各菌株D/d值在2.26-4.27之間，D/d 值最大的菌株是YP5，其余依次為 YP2＞YP1＞YP4＞YP3。利用磷鉬藍比色法測定各菌株發酵上清液中的有效含磷量，試驗結果如圖1所示，5株解磷細菌在液體培養基中的解磷量為23.6 mg/L-48.43 mg/L之間，其中解磷量最大的菌株是YP5（48.43 mg/L），有效含磷量與對照（5.63 mg/L）相比增加8.6倍，解磷能力由強及弱依次為YP5＞YP2＞YP1＞YP4＞YP3，此結果與溶磷圈法測定結果一致。YP5透明圈直徑和解磷量均高于其它菌株，具有優良的解有機磷作用，將對YP5進行鑒定和促生拮抗作用研究。

圖1 解磷細菌在液體培養基中的解磷能力Fig.1 Phosphate-solubilizing capacities of different stra-ins cultivated in liquid medium

表1 解磷細菌在固體培養基上的解磷能力Table 1 Phosphate solubilization capacity of different strains cultivated on solid nutrient medium

2.2 解磷細菌的鑒定

2.2.1 形態學觀察結果 YP5在NA培養基36℃培養24 h后進行菌落形態及細胞形態觀察，結果如圖2所示，菌落淡綠色，扁平，濕潤，邊緣不規則；革蘭氏染色反應顯微鏡觀察，YP5為革蘭氏陰性桿菌，菌體單個或成雙排列。

圖2 YP5的細胞形態（1）（×1 000倍）、菌落形態（2）和發酵液（3）Fig.2 Cell morphology（1）（×1 000 times），colony morphology（2），and fermentation broth of YP5（3）

2.2.2 生理生化試驗結果 YP5經API菌種鑒定系統，從API數據庫中獲得和該菌種序列相近種、屬鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），鑒定率為98.9%，其生理生化試驗結果如表2所示。將YP5進行16S rDNA鑒定。

表2 菌株YP5的生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification results of YP5

2.2.3 16S rDNA鑒定 以YP5的基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA基因通用引物進行PCR擴增，擴增出的1.5 kb左右長度的DNA片段（圖3）。BLAST比對分析發現，YP5與銅綠假單胞菌的同源性達100%。為明確菌株之間的親緣關系及系統地位，利用MEGA11 ALPHA構建系統發育進化樹（圖4），同時結合YP5的形態特征及生理生化試驗結果，鑒定YP5為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

圖3 YP5 16S rDNA的PCR產物電泳結果Fig.3 Electrophoresis result of YP5 16S rDNA PCR product

圖4 基于16S rDNA序列的YP5系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of YP5

2.3 解磷細菌促生拮抗因子測定

結果如圖5所示，YP5在CAS培養基平板上36℃培養7 d，菌落周圍產生橙色暈圈（圖5-A），說明該菌株能產鐵載體；在酪蛋白培養基上36℃培養2 d，菌落周圍產生39 mm-44 mm的透明圈，說明該菌株可分泌大量胞外蛋白酶（圖5-B）；在硅酸鹽和阿須貝培養基沒生長，說明YP5沒有解鉀和固氮作用；經檢測YP5也不產IAA。

圖5 菌株YP5產鐵載體（A）和分泌蛋白酶（B）試驗結果Fig.5 Results of producing iron carrier（A）and secreted protease（B）by strain YP5

2.4 藥敏實驗結果

選用15種抗生素對YP5進行藥敏實驗，結果如表3所示，YP5對諾氟沙星、氯霉素、慶大霉素、恩諾沙星和丁胺卡那霉素高度敏感，對萘啶酸、鏈霉素中度敏感，對氨芐西林、利福平和四環素等8種抗生素耐藥。

表3 YP5的藥敏實驗結果Table 3 Test results on the antimicrobial susceptibility of YP5

2.5 解磷細菌對植物真菌病害的拮抗作用

2.5.1 發酵液抑菌譜 采用平板對峙法測定YP5發酵液對植物病原真菌的拮抗作用，結果如圖6所示，YP5發酵液對水稻紋枯病菌、辣椒炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、花生褐斑病菌、玉米小斑病菌、番茄早疫病菌、甘蔗赤腐病菌、小麥赤霉病菌和冬瓜根腐病菌9種植物病原菌均有不同程度的抑制作用。如表4所示，YP5發酵液對不同病原菌抑制率在84.29%-51.07%之間，對冬瓜根腐病菌、花生褐斑病菌的抑制率達80%以上，對香蕉枯萎病抑制作用最弱，抑菌率為51.07%。深入研究YP5無菌濾液對植物病原菌的抑制作用。

圖6 YP5發酵液的拮抗作用Fig.6 Antagonistic activity of YP5 fermentation

2.5.2 無菌濾液的抑菌作用 用含體積濃度5% YP5無菌濾液的培養基測定對冬瓜根腐病菌9種植物病原菌的抑制作用。5% YP5無菌濾液對9種植物病原菌均有不同程度的抑制作用，結果如表4所示，抑制率在81.19%-52.18%之間，對冬瓜根腐病菌的抑制率最高，達81.19%。YP5發酵液和無菌濾液對植物病原菌均有拮抗作用。試驗進一步研究YP5的拮抗次生代謝物。

表4 YP5發酵液和無菌濾液的拮抗作用試驗結果Table 4 Antagonistic activity results of YP5 fermentation and cell-free filtrate

2.6 解磷細菌產申嗪霉素的定量分析鑒定

申嗪霉素又名吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA），是假單胞菌屬重要的拮抗次生代謝物。YP5不同溫度（28和36℃）下在KB培養基和黃豆浸粉培養基中PCA的產量，結果如圖7所示。28℃條件下，YP5兩種培養基中PCA的產量差異顯著，在KB培養基PCA的產量最高，為17.73 mg/L，在黃豆浸粉培養基中PCA的產量最低，為2.96 mg/L。36℃條件下，YP5兩種培養中PCA的產量差異不顯著，在KB培養基和黃豆浸粉培養基中PCA的產量分別為11.35 mg/L、10.86 mg/L。由此可知，菌株YP5在28℃，KB培養基中PCA的產量最高（17.73 mg/L）。在兩種培養基中，溫度不同PCA的產量差異顯著且變化趨勢不一致，在KB培養基中，PCA的產量隨溫度升高而降低；在黃豆浸粉培養基中，PCA的產量隨溫度升高而升高。

圖7 YP5在不同培養基中PCA的產量Fig.7 PCA content of YP5 （phenazine-1-carborglic acid）in the different medium

3 討論

隨著我國中藥行業的迅速發展，大量中藥藥渣也隨之產生，中藥藥渣成分中含有多種有益成分，是可循環使用的生物物料。高溫好氧堆肥是目前最常用的一種中藥渣處理方法。堆肥亦是一種潛在的解磷細菌來源。Hameeda等［28］、Nuraini等［29］和Atekan等［30］從農業廢棄物堆肥（稻草、玉米、花生、蓖麻葉、甘蔗和大型動物糞便）中分離出解磷細菌。中藥渣堆肥有豐富的微生物，本研究以堆肥2個月的中藥渣為試材，從中篩選到5株解有機磷細菌，各菌株發酵上清液中的解磷量在23.6 mg/L-48.43 mg/L之間，其中解磷量最大的菌株是YP5（48.43 mg/L），能有效提升發酵液中的有機磷含量8.6倍。伍善東等［31］從油菜（Brassica napus）根際土壤篩選得到的4株解有機磷細菌，解磷量在8.59 mg/L-28.34 mg/L；白變霞等［32］從南方紅豆杉（Taxus chinensis var.mairei）根際土壤分離得到的解有機磷菌株 CLY07的解磷量為26.62 mg/L。王明歡等［19］從中藥渣堆肥中篩選到2株解磷菌的解磷能力分別為2.68、4.60 mg/L。與目前已報道的解有機磷細菌相比，YP5具有良好的解磷作用。

銅綠假單胞菌是土壤促生菌中的常見種類，具有解磷、固氮等促生作用。Roopali等［33］從垃圾土中分離鑒定一株對印度芥藍有固氮和溶磷作用的銅綠假單胞菌。Linu等［34］從辣椒根際分離的解磷細菌銅綠假單胞菌KR270346和KR270347對辣椒土壤微生物數量和PSB種群、磷酸酶和脫氫酶活性、土壤有效磷、植物養分吸收和產量參數等各方面都有顯著影響。譙天敏等［35-36］通過抗生素標記法得到一株銅綠假單胞菌ZB27，對雜交竹梢枯病的防治效果可達到70.07%，并通過粗活性物質檢測試驗表明菌粗提物中具有生物活性的成分大多是極性較小的物質，其分子質量小于1 000 kD。但既有促生作用，又有拮抗作用的銅綠假單胞菌鮮見報道。本研究從中藥渣堆肥中篩選的解磷有機磷細菌銅綠假單胞菌YP5不但具有解磷作用，且其發酵液和無菌濾液對冬瓜根腐病等多種植物病原菌有良好的拮抗作用，抑菌率最高達80%以上。此外，HPLC試驗測定菌株YP5在KB培養基和黃豆粉培養基中均能產拮抗次生代謝物PCA，產量在2.96 mg/L-17.73 mg/L，YP5在28℃，KB培養基中PCA的產量最高（17.73 mg/L）。研究表明，培養基種類和溫度對PCA的產量均有影響。周蓮等［25］從水稻根際篩選能高效抑制水稻病原菌的銅綠假單胞菌PA1201在PPM和黃豆浸粉培養基中申嗪霉素的產量分別為81.7 mg/L和926.9 mg/L。這與本研究中培養基種類對PCA的產量有影響的結果一致。銅綠假單胞菌的次生代謝產物有很多種，如生長素、鐵載體、抗生素、酶和糖類等［37］。YP5能分泌胞外蛋白酶，產鐵載體、申嗪霉素，但其拮抗作用機制還需進一步研究。

4 結論

本研究從中藥渣堆肥中篩選出5株解有機磷細菌，通過溶磷圈法和磷鉬藍比色法測定其解磷作用，解磷能力最優的菌株是YP5（48.43 mg/L），有效含磷量與對照（5.63 mg/L）相比增加8.6倍。鑒定YP5為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），能分泌胞外蛋白酶，產鐵載體、申嗪霉素，對多種植物病原菌有廣譜拮抗作用。