美洲大蠊腸道產7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株的篩選及鑒定

唐彬 劉文彬 李小波 王寧 金小寶

（廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006）

紫杉醇（taxol）是一種二萜類抗癌化合物，已在臨床上廣泛應用于晚期卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等的治療［1-2］。紫杉醇市場需求大，但紫杉醇主要存在于資源有限、生長緩慢的紅豆杉屬植物的樹皮中，且含量僅有0.01%-0.07%，導致紫杉醇原料藥價格高昂，市場供不應求［3］。目前，紫杉醇的獲得方法有天然植物提取法、化學全合成法、化學半合成法、植物體外細胞培養法、植物內生真菌提取培養法以及代謝工程等［4］?；瘜W半合成是唯一得到應用的工業化生產方法。紫杉醇的半合成指以10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatin III，10-DAB）為前體通過10步化學反應合成紫杉醇［5］。7-木糖紫杉烷類化合物屬于紫杉醇母核類化合物，主要存在于紅豆杉的根、莖、葉中，含量豐富，這類化合物包括：7-木糖-10-去乙?；仙即迹?-β-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel，7-XDT）、7-木糖-10-去乙?；馍紝帀A、7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ等，如7-XDT在紅豆杉樹皮中的含量高達0.5%，但是在傳統的制備工藝中，這類化合物往往被當做副產物處理，沒有得到有效利用［6-7］。

7-木糖紫杉烷糖基水解酶（7-β-xylosyltaxanes glycoside hydrolases，7-β-xyl） 是 一 種 β-木 糖 苷 酶（EC3.2.1.37）。研究報道放線菌Leifsonia shinshuensis產生的7-β-xyl可通過水解7-XDT的C7位的木糖基團生成10-去乙酰紫杉醇（10-deacetylpaclitaxel，10-DAT）和10-DAB［8］。10-DAT雖無法用于目前的紫杉醇的半合成，但在紅豆杉中，10-去乙酰巴卡亭III 10 β-O-乙酰轉移酶（10-deacetylbaccatin III-10-β-O-acetyltransferase，DBAT）可直接通過C-10位羥基乙酰化反應將10-DAT轉化為紫杉醇［6］。蜚蠊、白蟻等蜚蠊目昆蟲均有食木的習性，已有研究報道美洲大蠊腸道內生菌可產生高活性木聚糖酶［9］，目前尚未見從美洲大蠊腸道內生菌中發現7-β-xyl的相關報道。課題組前期從美洲大蠊腸道分離獲得159株放線菌和122株非放線菌［10］。本研究擬從美洲大蠊腸道內生菌中篩選高產7-β-xyl的菌株，旨在為7-β-xyl提供新的酶源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 美洲大蠊腸道內生菌，為本課題組前期分離所得，保存于廣東省生物活性藥物研究重點實驗室。

1.1.2 主要培養基 高氏合成I號培養基；木聚糖液體培養基：硫酸銨1.0 g/L，磷酸氫二鉀7.0 g/L，磷酸二氫鉀3.0 g/L，七水硫酸鎂0.1 g/L，氯化鈉0.5 g/L，木聚糖2.0 g/L，蒸餾水溶解并定容至1 L，調節pH為7.2-7.4；木聚糖瓊脂培養基：在木聚糖液體培養基中加入1.5%的瓊脂。

1.1.3 主要實驗儀器 GelDoc XR+凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司，美國）；N-1300V-WB旋轉蒸發儀（日本東京理化器械株式會社，日本）；ZWY-1102C溫控回旋立式雙層搖床（上海智誠分析儀器制造有限公司，上海）；2695-2996高效液相色譜儀（美國Waters公司，美國）。

1.1.4 主要實驗試劑 7-XDT標準品（上海麥克林生化科技有限公司，Lot：C12006981）；10-DAT標準品（上海源葉生物科技有限公司，Lot：MO1028SE13）；10-DAB標準品（上海源葉生物科技有限公司，Lot：H11S9X70008）；玉米芯木聚糖（上海源葉生物科技有限公司，Lot：Y04J11J117661）；4-甲基傘形酮-β-D-木糖苷（上海源葉生物科技有限公司，Lot：K27D8B50806）；剛果紅（天津市福晨化學試劑廠）。

1.2 方法

1.2.1 產木聚糖酶菌株的篩選

1.2.1.1 剛果紅透明圈法初篩產木聚糖酶菌株 用滅菌牙簽挑選單菌落點接在以木聚糖為唯一碳源的木聚糖瓊脂平板培養基上，于28℃培養7 d。0.1%的剛果紅浸染30 min，再用1 mol/L的NaCl洗液脫色30 min。測量透明圈直徑（D）、菌落直徑（d），并計算透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）［11］。

1.2.1.2 熒光顯色法復篩產木聚糖酶菌株 木糖苷酶可水解4-甲基傘形酮-β-D-木糖苷的木糖苷鍵，生成小分子基團和熒光發色基團，在365 nm下可發出強烈熒光［12］。將4-甲基傘形酮-β-D-木糖苷噴灑于培養7 d具有透明圈的菌落上，靜置1 h，在365 nm紫外燈照射下觀察，同時拍照記錄。

1.2.2 薄層色譜法篩選產7-β-xyl菌株 參照Wang等［13］的方法，選取D/d值較大且熒光顯色的菌株作為受試菌株，挑取單個菌落接種于裝有100 mL木聚糖液體培養基的300 mL搖瓶中，28℃、180 r/min培養3 d，進行菌株增菌培養。再將5 mL的種子菌懸液接種于50 mL木聚糖液體培養基，繼續搖瓶發酵2 d，在發酵液中加入4 mL 0.5 mg/mL的7-XDT甲醇溶液，繼續培養4 d。發酵液于4℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮。每50 mL發酵液萃取物用1.5 mL甲醇溶解，以氯仿-甲醇（9∶1，V/V）為展開劑進行薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）點板，5%硫酸乙醇溶液100℃加熱顯色。7-XDT、10-DAT、10-DAB標準品溶液采用甲醇配制，濃度為0.5 mg/mL。

1.2.3 高產7-β-xyl菌株WA11-2-9的鑒定

1.2.3.1 形態學和生理生化鑒定 菌株WA11-2-9接種于高氏合成Ⅰ號培養基，置于28℃培養5-7 d，觀察菌落的形態特征，并通過革蘭染色法觀察菌體形態和顏色。根據《鏈霉菌鑒定手冊》［14］測定生理生化特性。

1.2.3.2 分子生物學鑒定 使用細菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，中國）提取菌株WA11-2-9的DNA，使用通用引物（27F ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R ：TACGGCTACCTTGTTACGACTT）對目標菌株的16S rDNA 基因進行擴增，取PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并送華大基因公司測序。將WA11-2-9的16S rDNA序列與NCBI與已知的序列進行同源性比對，將比對的結果利用Mega7.0軟件構建系統發育樹。同時將該菌株序列上傳至NCBI的GenBank數據庫，申請登錄號（GenBank Accession）。

1.2.4 轉化產物10-DAT轉化率的測定

1.2.4.1 10-DAT標準曲線的制備 分成配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 mg/mL 的 10-DAT溶液。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）重復進樣3次，測定10-DAT峰面積。繪制10-DAT濃度-峰面積標準曲線。

色譜條件：流動相為乙睛∶水（45∶55，V/V），檢測波長230 nm，檢測器PDA（光電二極管陣列），進樣體積10 μL，流速0.8 mL/min，柱溫室溫，色譜 柱 YMC-Pack ODS-AQ C18柱（250 mm×4.6 mm ODS-5 μm，12 nm）。

1.2.4.2 菌株WA11-2-9轉化率的測定 將從章節1.2.2得到轉化產物樣品進行HPLC分析，并與7-XDT、10-DAT、10-DAB三種標準品圖譜進行比對。重復進樣3次，測定轉化產物峰面積。樣品轉化產物10-DAT峰面積代入10-DAT標準曲線的線性回歸方程，計算轉化產物10-DAT的濃度。樣品轉化率（%）=生成10-DAT摩爾數/轉化前7-XDT摩爾數×100%。

1.2.5 7-β-xyl酶學性質的初步研究

1.2.5.1 最適反應溫度和pH 最適反應溫度：將粗酶液分別置于20、25、30、35、40、45和50℃水浴條件下反應后，測定β-木糖苷酶酶活，以最高酶活為100%，計算其相對酶活。最適反應pH：分別在 pH 為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件反應后，測定β-木糖苷酶酶活，以最高酶活為100%，計算其相對酶活。β-木糖苷酶的酶活測定方法參考湯勇等［15］的方法。

1.2.5.2 溫度穩定性、酸堿穩定性和金屬離子穩定性 溫度穩定性：將粗酶液分別在20、25、30、35、40、45和50℃提前孵育1 h，然后迅速冷卻至4℃，并測定β-木糖苷酶酶活，以未處理的酶液酶活為100%，計算其相對酶活。酸堿穩定性：將粗酶液用不同的pH的緩沖液稀釋10倍，4℃孵育1 h，并測定β-木糖苷酶酶活，以未處理的酶液酶活為100%，計算其相對酶活。金屬離子穩定性：配制 0.1 mol/L不同金屬離子溶液（Mg2+、Ca2+、Fe3+、Zn2+、Na+和K+），按 1 / 500 的體積比加入到酶液中，4℃孵育1 h，并測定β-木糖苷酶酶活，以未處理的酶液酶活為100%，計算其相對酶活。

2 結果

2.1 產木聚糖酶菌株的篩選

根據產透明圈和產熒光顯色的指示，測試的178株美洲大蠊腸道內生菌中，55株菌具有木聚糖酶活性。如圖1-A所示，55株菌中包含41株放線菌和14株非放線菌。41株放線菌分屬于6個屬，包含鏈霉菌屬（Streptomyces）30 株、纖維菌屬（Cellulomonas）4株、小單胞菌屬（Micromonospora）3株、白蟻菌屬（Isoptericola）2株、無色桿菌屬（Achoromobacter）1株、戈登氏菌屬（Gordonia）1株。如圖1-B所示14株非放線菌包含3株巴氏菌（Pasteurella）、3株腸球菌（Enterococcus）、2株貪銅菌（Cupriavidus）、2株檸檬酸桿菌（Citrobacter）、2株嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、1株克呂沃爾氏菌（Kluyvera）、1株摩根氏菌（Morganella）。剛果紅水解圈結果如圖2所示，透明圈直徑（D）、菌落直徑（d）以及透明圈直徑與菌落直徑比值（D/d）如表1所示，菌株熒光顯色圖如圖3所示。

圖3 產木聚糖酶菌株的熒光顯色圖Fig.3 Fluorescence color image of xylanase-producing strain

表1 產木聚糖酶菌株的菌落直徑、剛果紅透明圈直徑及比值Table 1 Colony diameters，Congo red transparent circles and their ratios of xylanase-producing strains（n=3）

圖1 產木聚糖酶菌株種屬分布Fig.1 Distribution of xylanase-producing strains

圖2 產木聚糖酶菌株的剛果紅水解圈Fig.2 Congo red transparent circles of xylanase-producing strains

2.2 產7-β-xyl菌株的篩選和轉化產物的初步鑒定

TLC結果顯示7-XDT的轉化產物以10-DAT為主，未見明顯10-DAB斑點。其中10株菌具有將7-XDT轉化為10-DAT的能力，分別為8株鏈霉菌（WA 1-37、WA 2-17、WA 2-34、WA 3-2-36、WA 4-65、WA 11-1-1、WA 11-1-3和WA 11-2-9）和2株貪銅菌（WA 14-2-3和WA 14-2-7）。其中菌株WA11-2-9有較好的轉化效果，故選取菌株WA11-2-9進行后續研究。轉化產物TLC顯色如圖4所示。

圖4 菌株WA11-2-9轉化產物TLC結果Fig.4 TLC result of transformed product of strain WA11-2-9

2.3 菌株WA11-2-9的鑒定

2.3.1 菌株WA11-2-9的形態學觀察 菌株WA11-2-9菌落在高氏合成Ⅰ號培養基上呈圓形，灰白色，干燥無光澤，不透明，輕微隆起（圖5-A）。革蘭染色為陽性，菌體呈短桿形（圖5-B）。基本符合鏈霉菌的形態特征。

圖5 菌株WA11-2-9的形態學特征Fig.5 Morphological characteristics of strain WA11-2-9

2.3.2 菌株WA11-2-9的生理生化鑒定 WA11-2-9生理生化試驗結果如表2所示，結果基本符合Streptomyces enissocaesilis的生理生化特性。

表2 菌株WA11-2-9的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain WA11-2-9

2.3.3 菌株WA11-2-9的分子生物學鑒定 將PCR反應產物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，結果（圖6-A）顯示目的條帶在1 000-2 000 bp之間。經測序、Blast同源性比對，結果（圖6-B）表明該菌株與Streptomyces enissocaesilis strain NRRL B-16365處于同一分支，相似性高達100%。結合形態學、生理生化特性和分子生物學特征可將菌株WA11-2-9鑒定為Streptomyces enissocaesilis。將菌株WA11-2-9的16S rDNA通過 Bankit 向 GenBank 申請獲得登錄號為MZ411692。

圖6 菌株WA11-2-9 分子生物學鑒定Fig.6 Molecular biology identification of strain WA11-2-9

2.4 轉化產物10-DAT轉化率的測定

2.4.1 10-DAT標準曲線的制備 以10-DAT濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。10-DAT標準曲線如圖7所示。線性回歸方程為y = 2 587x +45.60，R2= 0.999，線性擬合良好。

圖7 10-DAT的標準曲線Fig.7 10-DAT standard curve

2.4.2 標準品和菌株WA11-2-9的HPLC分析圖譜結果 由圖8可知，7-XDT、10-DAT、10-DAB三種標準品保留時間分別為10.595 min、17.873 min和5.776 min。菌株WA11-2-9轉化產物在10.595 min、17.852 min和5.762 min均有吸收峰，表明可WA11-2-9可將7-XDT轉化為10-DAT和10-DAB，轉化產物以10-DAT為主，經計算菌株WA11-2-9將7-XDT轉化為10-DAT的轉化率為21.52%。

圖8 菌株WA11-2-9轉化產物的HPLC分析圖譜Fig.8 HPLC analyzing spectrum of transformed product of strain WA11-2-9

2.5 7-β-xyl酶學性質的初步結果

2.5.1 最適反應溫度和pH 7-β-xyl酶促反應最適反應溫度是35℃（圖9-A），最適反應pH為6.0（圖9-B）。

圖9 7-β-xyl的最適反應溫度和pHFig.9 Optimal reaction temperature and pH of 7-β-xyl

2.5.2 溫度穩定性、酸堿穩定性、金屬離子穩定性 7-β-xyl在20℃時最穩定，隨著溫度逐漸上升，穩定性逐漸下降（圖10-A）；7-β-xyl在pH 6-7范圍內穩定性較強，酶活力超過70%（圖10-B）；金屬離子的穩定性如圖10-C所示，Ca2+、Zn2+、K+對酶活有促進作用，其中Ca2+作用最為顯著，而Na+、Mg2+稍有抑制作用，Fe3+有較強的抑制作用。

圖10 7-β-xyl的溫度穩定性、酸堿穩定性和金屬離子穩定性Fig.10 Thermal stability，pH stability and metal ion stability of 7-β-xyl

3 討論

β-木糖苷酶屬于木聚糖酶，是木聚糖類半纖維素水解酶系的重要組成部分，主要催化水解木糖苷基團［16］。β-木糖苷酶主要存在于細菌、真菌、放線菌等微生物和部分高等植物中［17-18］。7-β-xyl是一種β-木糖苷酶，已在放線菌和細菌、真菌中發現［19］。美洲大蠊，俗稱蟑螂，食性復雜，腸道生理生化環境

復雜特殊，腸道微生物菌群多樣［20］。本研究通過篩選發現美洲大蠊腸道中鏈霉菌、纖維菌、小單胞菌、棲白蟻菌、無色桿菌、戈登氏菌等放線菌和巴氏菌、腸球菌、貪銅菌、檸檬酸桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、克呂沃爾氏菌、摩根氏菌等非放線菌均可產木聚糖酶。進一步研究發現其中美洲大蠊腸道內生鏈霉菌和貪銅菌均可產7-β-xyl。在此之前有其他學者已在鏈霉菌中發現了 7-β-xyl，如 Wang 等［13］和劉宇等［21］分別研究發現馬特鏈霉菌、天藍色鏈霉菌具有產生7-β-xyl的能力。

微生物轉化法是利用微生物自身的酶類進行轉化，與化學合成法相比具有反應條件溫和且選擇性強、環保無環境污染、副產物少、后處理簡單等優勢［22］。目前已有研究通過微生物轉化法利用7-木糖紫杉烷類化合物或紅豆杉樹枝生產紫杉醇的半合成底物。李勇超等［23］發現用紅豆杉枝條與菌株 Trichoderma sp.耦合發酵，可用于生產10-DAB；朱鳳芝等［24］從污水處理廠污水中篩選中一株可將巴卡廷III高效轉化為10-DAB的團泛菌（Pantoea agglomerans）。本研究中高產 7-β-xyl的菌株WA11-2-9鑒定為Streptomyces enissocaesilis，暫未看到Streptomyces enissocaesilis能產生β-木糖苷酶的報道。7-XDT的轉化研究中顯示WA11-2-9可將7-XDT轉化為10-DAT和10-DAB，且以10-DAT為主。這說明7-XDT發生了C-7木糖水解反應生成了主要產物10-DAT，同時也發生了13位側鏈水解反應產生了副產物10-DAB，結果同李建華［25］的一致。因此推測7-β-xyl有不同亞型，從而導致7-XDT酶解產物的多樣化，如只產10-DAT、只產10-DAB、既產10-DAT又產10-DAB。文獻報道7-XDT通過糖基水解酶LXYL-P1-2和DBAT相偶聯，將7-XDT直接轉化為紫杉醇［6］，這提示我們在后續研究中可以通過基因工程技術在紅豆杉細胞中過表達7-β-xyl基因，促進紅豆杉中紫杉醇的表達。也可以通過在體外共表達7-β-xyl和DBAT，通過“一鍋法”酶催化合成紫杉醇。

進一步研究顯示WA11-2-9將7-XDT轉化為10-DAT的轉化率為21.52%。李建華等［26］從土壤微生物中篩選獲得3株能夠特異將7-XDT轉化為10-DAT的微生物，但是轉化率僅為5%。在張衡的研究中通過培養基優化，使ITM-1512菌株10-DAT的轉化率可達到 40.66%±13.22%［27］。Li等［28］對嗜熱細菌Dictyoglomus turgidum中的7-β-xyl進行了原核表達，獲得的重組酶將7-XDT轉化為10-DAT的轉化率達到了98%。Dou等［29］從云南紅豆杉的根際土壤中分離得到一株能產生7-β-xyl的Cellulosimicrobium cellulans菌株，并通過優化7-β-xyl粗酶的反應條件顯著提高7-β-xyl的轉化效率，3 h可以將98%的7-XDT轉化為10-DAT。上述研究提示我們在后續的研究中，應通過優化產酶培養基、優化反應條件、酶學性質的研究等方法進一步提高WA11-2-9的7-β-xyl轉化效率。

4 結論

從178株美洲大蠊腸道內生菌中篩選出55株菌產木聚糖酶，其中8株鏈霉菌和2株貪銅菌可產生7-β-xyl。高產菌株WA11-2-9經形態學特征、生理生化試驗和16S rDNA序列分析鑒定為Streptomyces enissocaesilis。菌株WA11-2-9可將7-XDT轉化為10-DAB和10-DAT，主要產物10-去乙酰紫杉醇的轉化率為21.52%。