基于CRISPR/Cas9技術構建Plin1基因敲除小鼠模型及表型分析

燕炯 馮晨毅 高學坤 許祥 楊佳敏 陳朝陽

（1. 山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，太原 030001；2. 山西醫(yī)科大學實驗動物中心，太原 030001）

脂滴（lipid droplet，LD）是大多數(shù)真核細胞中儲存胞質(zhì)中性脂質(zhì)的細胞器。長期以來，LD僅被視為是惰性的脂肪儲存庫，而如今普遍認為LD是細胞代謝最主要的調(diào)節(jié)器之一［1］。研究發(fā)現(xiàn)，LD表面有上百種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)著LD的生物發(fā)生，并在細胞間通訊、信號傳導以及免疫反應等多種生理過程中具有重要作用［2］。

Perilipins是LD表面蛋白家族之一，在哺乳動物中，該家族包含5個成員，其基因序列相似并均具有錨定于LD表面的氨基酸末端序列。圍脂滴蛋白（perilipin1，PLIN1）是該家族中最主要的成員，其作為脂肪細胞分化成熟的標志在白色脂肪組織中高度表達，也存在于肝臟，肌肉等組織中［3-5］。近年來的研究顯示，PLIN1調(diào)節(jié)著脂肪細胞的脂質(zhì)代謝和炎癥反應，并與肥胖，糖尿病，高血壓等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［6-10］。然而，目前關于PLIN1在體內(nèi)的生物學功能尚未完全闡明，仍需要在整體和活體水平進一步研究。本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術構建Plin1基因敲除小鼠，并對其表型進行初步分析，為后續(xù)在體內(nèi)研究PLIN1作用及機制提供良好的途徑與基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑：重組Cas9蛋白購自北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司；M2培養(yǎng)基、透明質(zhì)酸酶購自美國Sigma公司；pX330質(zhì)粒購自美國Addgene公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；大腸桿菌DH5 α感受態(tài)購自北京天根生化科技有限公司；sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司；DNA和RNA提取、回收試劑盒及PCR實驗相關試劑購自北京天根生化科技有限公司；Perilipin1（ab192716）抗體購自英國Abcam公司，GAPDH（#5174）、β-actin（#3700）抗體購自美國CST公司。

主要儀器：Stepone plus熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems），ON3-99D顯微操作系統(tǒng)（日本Olympus公司），MF-900拉針儀（日本Narishige公司）。

實驗動物：SPF級別4周齡、15-30 g、100只C57BL/6j小鼠購自賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司（SCXK（粵）2018-0032）。飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學動物實驗中心（SYXK（晉）2019-0007）。飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水，D1245高脂飼料和D12450B小鼠生長維持飼料購自北京斯貝福生物技術有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在24-28℃。所有操作均符合實驗倫理學要求（審批號 ：ACU20-I001）。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA的設計與篩選 在NCBI中查詢小鼠Plin1基因基本信息，利用在線sgRNA設計工具（http://crispr.mit.edu/），針對Plin1基因2號外顯子前后序列設計sgRNA，敲除策略如圖1所示。脫靶位點、基因數(shù)和發(fā)生錯配的可能性大小進行評估，篩選出2條評分較高sgRNA，sgRNA及其PAM序列見表1。以設計好的sgRNA為模板互補配對相應的反義鏈，并在5′端增加黏性末端后交北京微旋基因技術有限公司合成。

表1 sgRNA序列Table 1 sgRNA sequence

圖1 sgRNA敲除Plin1基因2號外顯子的示意圖Fig.1 Schematic diagram of sgRNA knocking out exon 2 of Plin1 gene

1.2.2 sgRNA表達載體的構建與體外轉(zhuǎn)錄 將sgRNA雙鏈退火磷酸化后稀釋至1 μmol/L，同時利用限制性內(nèi)切酶Bbs I切割pX330骨架質(zhì)粒載體使其線性化，DNA回收試劑盒回收線性化質(zhì)粒載體后分別與2條sgRNA雙鏈在含有T4 DNA連接酶的體系中進行連接，16℃過夜。構建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化至DH5α菌群中，常規(guī)培養(yǎng)2 d后提取質(zhì)粒DNA進行ApaL I+Nco I雙酶切法鑒定并進行測序檢測。載體構建成功按照試劑盒說明書設計引物進行PCR獲得sgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板，引物序列為：SG-F1：TTAATACGACTCACTATAGGGTTGGAGGGCGAATGTTACATGTTTTAGAGCTAGAAATAG，SG-F2：TTAATACGACTCACTATAGGGTTGGAGGGCGAATGTTACATGTTTTAGAGCTAGAAATAG，SG-R：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC，利用sgRNA轉(zhuǎn)錄模板體外轉(zhuǎn)錄后檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小及完整性，并使用RNA純化試劑盒進行純化，通過微孔板分光光度計測定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的的濃度和純度（A260/A280值）。

1.2.3 受精卵的獲得與顯微注射 5-10 IU的孕馬血清和人絨毛膜促性腺激素促使雌性小鼠超數(shù)排卵后與雄性小鼠合籠，次日挑取見栓雌鼠剪取雙側(cè)輸卵管，置于含有3%透明質(zhì)酸酶液滴的培養(yǎng)皿中，用精細鑷子撕破壺腹部使受精卵流出，短暫消化至受精卵散開后用M2培養(yǎng)基清洗3次，移入一個含有M2培養(yǎng)基液滴的新培養(yǎng)皿中并加入礦物油，置于顯微注射操作系統(tǒng)中。將sgRNA與Cas9蛋白混合后調(diào)整至適宜濃度，通過注射針向受精卵原核中注射1-2 pL，注射完畢后，挑取存活的受精卵移入M16培養(yǎng)基中，5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)2 h。

1.2.4 Plin1基因小鼠的獲得及基因型鑒定 將經(jīng)顯微注射后培養(yǎng)存活的受精卵通過輸卵管傘端移植入假孕雌鼠體內(nèi)，19-21 d后小鼠出生剪尾提取DNA，PCR及測序進行基因型鑒定篩選，獲得F0代小鼠；F0代小鼠與異性野生型小鼠交配，后代基因型鑒定獲得F1代雜合型基因敲除小鼠；F1代雜合小鼠雌雄近交，后代基因型鑒定獲得F2代純合型基因敲除小鼠。針對敲除區(qū)域設計了F、R1和R2三條引物鑒定基因敲除及野生型小鼠，鑒定策略如圖2所示，引物序列見表2所示。

圖2 Plin1基因小鼠敲除基因型鑒定的策略Fig.2 Strategies for genotype identification of Plin1 knockout mice

表2 基因型鑒定的引物序列Table 2 Primer sequence for genotyping

1.2.5 小鼠一般體格指標測定 常規(guī)喂養(yǎng)4周后，以同窩別雜合及野生型小鼠作為對照，測量小鼠空腹體重、體長并記錄每周攝食量。

1.2.6 qRT-PCR檢測小鼠PLIN1 mRNA水平 提取小鼠肝臟、骨骼肌及脂肪組織中總RNA，去除gDNA后加入反轉(zhuǎn)錄體系，95℃加熱3 min獲得cDNA。按照2× M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（with Tli RNaseH）使用說明書以及Light Cycler 96 System操作說明配置反應體系，PCR反應條件為95℃ 預變 性 30 s后，95℃ 5 s，60℃ 20 s，65℃ 15 s，40個循環(huán)條件PCR。引物序列F：5′-CAACCCTGCTGGATGGAGACCT-3′，R ：5′-GGTGGGCTTCTTTGGTGCTGTT-3′，以小鼠gapdh作為內(nèi)參基因，引物序列F ：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，R ：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.2.7 Western-blot檢測小鼠PLIN1蛋白表達水平 提取小鼠肝臟、骨骼肌及脂肪組織中總蛋白并定量蛋白濃度，100℃金屬浴變性后制備SDS-PAGE凝膠。80 V，15 min；100 V，60 min電泳后；120 min，220 mA恒流轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂奶粉封閉后一抗（稀釋比例為1∶1 000）孵育，4℃過夜，室溫二抗孵育120 min。NC膜漂洗數(shù)次后滴加ECL plus，于成像系統(tǒng)下曝光。Image J軟件檢測各蛋白條帶灰度值，以GAPDH或β-actin條帶進行校正。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 本次研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行分析，各組數(shù)據(jù)采用描述，組間比較采用one-way ANOVA，P ＜ 0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 sgRNA表達載體鑒定及體外轉(zhuǎn)錄

如 圖 3-A所 示，ApaL I（ 第 6 376、6 837和8 119位置）+Nco I（第654和1 181位置）酶切sgRNA表達載體后，獲得了5個預期的大小的片段（497、527、959、1 246和5 195 bp）；如圖3-B所示，經(jīng)基因測序后，sgRNA-Plin1-1、2插入在pX330 gRNA scafflod位置，表明sgRNA表達載體Plin1-1、2構建成功；sgRNA表達載體完全體外轉(zhuǎn)錄后，獲得sgRNA體外轉(zhuǎn)錄片段完整，如圖3-C所示，大小在100-200 bp之間，與預期結果一致。對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行純化回收，濃度均大于5 000 ng/L，A260/A280比值為2.03±0.06，表明體外轉(zhuǎn)錄sgRNA成功。

圖3 sgRNA表達載體構建與鑒定Fig.3 Construction and identification of sgRNA expression vector

2.2 純合型Plin1基因敲除小鼠的獲得

本研究通過顯微注射受精卵數(shù)共213枚，可移植卵數(shù)為118枚，分別移植入4只假孕雌鼠體內(nèi)；出生小鼠24只，出生率為20.3%；其中F0陽性鼠12只（5♂7♀），陽性率為50.0%，F(xiàn)0代陽性小鼠Plin1基因缺失740 bp左右，PCR電泳結果如圖4-A所示；選擇8號F0雄性小鼠測序后與8周齡野生型雌鼠交配，獲得F1代小鼠13只（4♂9♀）；F1代雜合型小鼠雌雄近交獲得F2代純合型小鼠2只（1♂1♀）、雜合型小鼠13只（6♂7♀）及野生型小鼠2只（2♀）；F1代小鼠PCR電泳結果如圖4-B-C所示；F0代8號小鼠和部分F1代小鼠基因測序結果如圖4-D所示；F2代小鼠基因型的鑒定結果如圖5所示。

圖4 F0和F1代小鼠基因型鑒定Fig.4 Genotype identification of F0 and F1 generation mice

圖5 F2代小鼠基因型鑒定Fig.5 Genotype identification of F2 generation mice

2.3 純合Plin1基因敲除小鼠一般指標

常規(guī)飼料喂養(yǎng)4周后，與同周齡野生型小鼠相比，F(xiàn)2代雜合型Plin1基因敲除小鼠體重、體長及每周攝食量并無明顯變化，而F2代12，13號小鼠近交獲得的F3代純合型Plin1基因敲除小鼠體重顯著降低，差異有顯著性（P ＜ 0.05）；體長與每周攝食量差異無顯著性表達（表3）。

表3 各組小鼠體格參數(shù)Table 3 Physical parameters of mice in each group

2.4 純合型Plin1基因敲除小鼠PLIN1 mRNA水平

取F3代純合型、F2代雜合型Plin1基因敲除小鼠及同窩別的野生型小鼠各2只，Q-RT-PCR檢測小鼠肝臟、骨骼肌、白色脂肪組織中PLIN1 mRNA水平，如圖6所示，相比于野生型小鼠Plin1基因敲除小鼠在各組織中PLIN1 mRNA水平顯著降低（P ＜ 0.05），雜合型Plin1基因敲除小鼠PLIN1 mRNA水平降低約49.3%（a：肝臟48.0%、b：骨骼肌51.1%、c：白色脂48.7%），純合型Plin1基因敲除小鼠基本無PLIN1 mRNA表達。

圖6 小鼠各組織中PLIN1 mRNA的相對表達量Fig.6 Relative expressions of PLIN1 mRNA in the various tissues of mice

2.5 純合型Plin1基因敲除小鼠PLIN1蛋白表達水平

Western-blot檢測小鼠各組織中PLIN1的蛋白表水平，如圖7所示，相比于野生型小鼠，Plin1基因敲除小鼠在各組織中PLIN1蛋白的表達水平顯著降低（P ＜ 0.05），雜合型Plin1基因敲除小鼠PLIN1蛋白水平降低了46.5%（A：肝臟41.1%、B：骨骼肌60.9%、C：白色脂肪37.5%），純合型Plin1基因敲除小鼠基本無PLIN1蛋白表達。

圖7 小鼠各組織中PLIN1的蛋白表達水平Fig.7 Protein expressions of PLIN1 in the various tissues of mice

3 討論

人類Plin1基因單拷貝編碼PLIN1，位于15號染色體（15q26.1）的長臂上，基因編號5346，其DNA長度大于15 kb，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5346）［10］。 研究發(fā)現(xiàn)，Plin1基因與人群肥胖的發(fā)生密切相關，在2005年已被列為肥胖相關基因之一［11］。然而，關于Plin1基因與肥胖發(fā)生關系的研究大多集中在細胞及組織水平，缺乏從整體動物水平著手的相關研究。鑒于目前通過基因敲除建立穩(wěn)定的實驗動物模型已成為研究基因功能的金標準，因此我們構建了Plin1基因敲除小鼠模型，旨在進一步在動物體內(nèi)研究該基因的功能。

CRISPR/Cas9作為第三代基因編輯技術，得益于其操作簡單、高效率和低成本的優(yōu)勢在基因編輯領域被廣泛應用［12-13］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)組分包括Cas9蛋白和sgRNA，通過sgRNA識別目的基因并引導Cas9蛋白切割，在靶點位置造成雙鏈斷裂，之后再在DNA損傷修復機制的作用下實現(xiàn)移碼突變以達到基因敲除的目的［14］。利用顯微注射等技術將靶向目的基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)組分遞送至受精卵中后再對其進行胚胎移植是目前獲得基因敲除小鼠最便捷的方法［15］。在前期研究中，我們已經(jīng)成功構建了Plin1基因敲除載體并在細胞內(nèi)外驗證了其切割活性［16］。而在本次研究中，我們基于CRISPR/Cas9技術在Plin1基因2號外顯子前后序列設計一對sgRNA，通過構建sgRNA表達載體和體外轉(zhuǎn)錄，獲得了預期的sgRNA片段，之后通過與Cas9蛋白混合并利用顯微注射的方式遞送至小鼠受精卵細胞中，PCR和基因測序結果表明成功敲除了包含Plin1基因2號外顯子序列在內(nèi)741 bp片段。之后通過F0代小鼠和野生型小鼠的雜交及子代小鼠的不斷近交，在敲除區(qū)域中設計引物，通過PCR鑒定篩選得到了純合型Plin1基因敲除小鼠。

PLIN1是一種相對分子質(zhì)量為56-62 kD的LD表面蛋白，由522個氨基酸組成，高表達于白色脂肪組織中，也存在于在肝臟、肌肉等組織中［17］。研究發(fā)現(xiàn)，PLIN1在LD表面充當?shù)鞍灼琳喜⑴c比較基因 鑒 定 58（comparative gene identification-58，CGI-58）結合，在基礎狀態(tài)下避免LD中的中性脂質(zhì)被無效降解，在激素刺激作用介導激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）至脂滴表面的易位，同時釋放CGI-58活化脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）促進脂解［18-19］。課題組前期利用RNAi技術已證實沉默Plin1基因下調(diào)了3T3-L1脂肪細胞中PLIN1的表達后，促進了脂肪細胞脂解，降低了胞內(nèi)TG的水平［20-21］。有研究也發(fā)現(xiàn)，Plin1基因敲除和過表達小鼠對高脂飲食誘導的肥胖均具有抵抗作用［22-23］。本次研究結果顯示，敲除Plin1基因2號外顯子在內(nèi)741 bp后實現(xiàn)了移碼突變，雜合及純合型Plin1基因敲除小鼠各組織中PLIN1 mRNA和蛋白表達顯著下調(diào)，純合型Plin1基因敲除小鼠基本無PLIN1 mRNA和蛋白表達。通過常規(guī)飼料喂養(yǎng)4周后初步分析其表型發(fā)現(xiàn)，相比于野生及雜合型小鼠，純合型Plin1基因敲除小鼠體重明顯降低，這可能是由于PLIN1失活后，LD表面失去了蛋白屏障，脂解酶易于水解其內(nèi)的脂質(zhì)，LD的體積縮小，從而導致脂肪組織萎縮所引起的，但具體作用及機制尚待進一步探究。

綜上所述，本研究基于CRISPR/Cas9技術成功構建了純合型Plin1基因敲除小鼠，初步表型分析發(fā)現(xiàn)純合型Plin1基因敲除小鼠體重相比于野生型小鼠顯著降低，較為瘦小。這些結果為在體內(nèi)進一步研究PLIN1的功能及其與肥胖發(fā)生的關系奠定了基礎。

4 結論

本研究基于CRISPR/Cas9技術成功構建了Plin1基因敲除小鼠模型，并且發(fā)現(xiàn)Plin1基因敲除小鼠體型較為瘦小。這為后續(xù)探究PLIN1的功能及其與肥胖的關系提供了技術支持和參考依據(jù)。