AAV介導的RNAi對SARS-CoV-2 S基因表達的抑制作用

劉曉玫 王東鑫 張春 魏雙施

（中國科學院生物醫學檢驗技術重點實驗室 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所，蘇州 215163）

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引發了2019冠狀病毒病（COVID-19）全球大流行疫情。目前，該病毒已在全球范圍內導致上億人感染，當前疫情仍在蔓延中，給人類健康帶來了巨大的威脅。SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科，與SARSCoV、MERS-CoV、Bat-SL-CoV同屬于β冠狀病毒屬［1］。基因組為線性單股正鏈的RNA，主要編碼三類病毒蛋白：結構蛋白（structural protein）、非結構蛋白（non-structure protein），以及附屬蛋白（accessory protein）。S蛋白構成病毒表面的刺突，通過（receptor-binding domain，RBD）與宿主細胞表面的受體結合，使病毒得以吸附、侵入細胞［2］。隨著全球范圍內的傳播，SARS-CoV-2還在不斷地發生變異，這無疑會加大藥物的研發難度和時間。因此，需要一種快速、靈活性高的抗新冠病毒治療方案。

RNA干擾（RNAi）是最早在植物中發現的一種抗病毒自然免疫機制，為序列特異性的，轉錄后的基因沉默［3］。RNAi的生物學機制是由小的雙鏈RNA靶向同源mRNA，誘導其發生降解。RNAi技術的抗病毒潛力首先是在抗呼吸道合胞病毒感染中被證明的［4］，隨后應用于多種病毒性傳染病的治療研究中，包括人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）、丙型肝炎病毒（HCV）、乙肝病毒（HBV）、埃博拉病毒（Ebolavirus）、甲型流感病毒（Influenza A virus）等［5］。此外，研究發現利用RNAi能夠有效地抗SARS-CoV感染，且無毒性效應［6-8］。相對于傳統的病毒性傳染病治療藥物，RNAi治療有其獨特的優勢，如，高度序列特異性的基因沉默，對治療目標無選擇，易于設計、構建和驗證。而主要挑戰在于，如何以有效、安全的方式將siRNA精確地遞送至靶細胞和器官，并保持其穩定性。

重組腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體是目前公認的最有前景的基因治療遞送載體。rAAV具有安全性高、免疫原性和細胞毒性低、宿主范圍廣等優勢。目前尚未見利用AAV介導的RNAi在抗SARS-CoV-2感染中的報道。本研究以SARS-CoV-2 S基因為靶標設計shRNA，利用rAAV載體高效遞送，旨在探索抗SARS-CoV-2感染的可能方法。

1 材料與方法

1.1 材料

pFastBacDual-ITR-CMV-EGFP質 粒、pFastBac-Dual-scITR-CMV-EGFP質粒、pFastBacDual-inCap6質粒、pAAV-U6質粒、pFastBacDual-ITR-PRDX6-T2AEGFP質粒、pFastBacDual-inRep質粒、大腸桿菌SURE2感受態細胞、DH10Bac均由中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所細胞和基因治療研究中心構建或保存；pcDNA6B-nCoV-S-FLAG 由山東大學高等醫學研究院王培會教授惠贈；siRNA DNA序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。293T細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。6周齡C57BL/6小鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物實驗經中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所實驗動物倫理委員會審查批準，符合動物福利倫理要求。

限制性內切酶購自NEB公司，T4 DNA 連接酶購自Thermo Fisher公司，KOD-Plus高保真聚合酶購自TOYOBO公司，質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，無縫克隆試劑盒、RNA抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白電泳試劑、HRP標記的山羊抗小鼠二抗、actin抗體等購自碧云天生物技術公司、cDNA合成試劑、qPCR Mix購自翌圣生物科技（上海）有限公司，抗S單克隆抗體為中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所血液免疫學研究中心制備。DMEM培養基購自Hyclone公司、胎牛血清購自四季青公司。PEI轉染試劑購自Polyscience公司。

1.2 方法

1.2.1 SARS-CoV-2 S基因克隆 以pcDNA6B-nCoVS-FLAG質粒為模板PCR擴增S基因，引物為：上游 引 物 5′-CGAACATCGATTGAATTCGCCACCATGG TCTCTAGTCAGTGTGTTAATCT-3′，下游引物 5′-AGG TGATGGTGATGGTGATGTGTGTAATGTAATTTGACT CC-3′。以 pFastBacDual-ITR-PRDX6-T2A-EGFP 質粒為模板擴增T2A-EGFP序列，引物為：上游引物5′-CAAGGATGACGACGATAAGGGAAGCGGAGAGGGC AGAGG-3′，下游引物為 5′-GATGAGTTTTTGTTCGA ACCGCGGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。通過EcoR I和Xho I雙酶切去掉pFastBacDual-ITR-CMVEGFP質粒中的EGFP基因，保留其余骨架，通過無縫克隆將S基因和T2A-EGFP PCR產物一步連接到骨架中，獲得重組質粒pFastBacDual-ITR-S-T2AEGFP。

1.2.2 shRNA設計與克隆 通過在線 RNAi 設計網站（BLOCK-iTTMRNAi Designer）靶向 SARS-CoV-2（MN908947.3）S基因設計若干 shRNA 序列，NCBI blast 驗證其特異性。shRNA 序列從 5′到 3′的順序依次為過客鏈、loop 環和引導鏈。shRNA 寡核苷酸序列如表1所示。頂鏈和底鏈退火形成雙鏈，具體方法為：100 μmol/L濃度的寡核苷酸頂鏈和底鏈各2 μL中加入5×退火緩沖液，用水補充至10 μL，在PCR儀中95℃ 孵育4 min，自然冷卻到室溫，此過程可產生互補的雙鏈DNA。pAAV-U6質粒用Bsa I酶切純化后，與退火的雙鏈DNA連接，得到pAAV-U6- shRNA/S質粒，測序鑒定連接的正確性。

表1 shRNA 寡核苷酸序列Table 1 Oligonucleotide sequence of shRNA

1.2.3 細胞培養與轉染 293T細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM完全培養基中。轉染前一天，細胞以1.5×105個/孔的密度接種于24孔板中。0.5 μg的pFastBacDual-ITR-S-T2A-EGFP 和 0.5 μg的 pAAV-U6-shRNA/S質粒共同轉染細胞，未插入shRNA寡核苷酸序列的pAAV-U6空質粒作為陰性對照，轉染試劑為聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）。具體轉染方法為：1.2 μL 50 mmol/L PEI 用HBS緩沖液稀釋到15 μL，兩種質粒同時加到HBS緩沖液中至總體積15 μL，分別于室溫作用10 min，再將PEI溶液加入到質粒溶液中，混勻，室溫作用10 min，然后將轉染試劑輕輕滴加到細胞上。用熒光顯微鏡觀察轉染效率，48 h后收集細胞進行檢測。

1.2.4 重組腺相關病毒（rAAV）包裝和純化 pAAV-shRNA/S質粒通過Mlu I和BstE II酶切，連接到pFastBacDual-scITR-CMV-EGFP質粒骨架中，獲得pFastBacDual-scITR-shRNA/S。將pFastBacDual-scITR-shRNA/S質 粒、pFastBacDual-inCap6質 粒、pFast-BacDual-inRep質粒分別轉化大腸桿菌DH10Bac感受態細胞中，經過藍白斑篩選獲得相應的桿粒Bacmid。Bacmid轉入Sf9細胞中包裝產生桿狀病毒Baculovirus，將桿狀病毒擴增至P3代。3種桿狀病毒共同感染昆蟲細胞Sf9，包裝獲得rAAV，經過CsCl密度梯度離心的方法純化rAAV病毒；熒光定量PCR標準曲線法檢測rAAV病毒的滴度，pAAV-U6質粒測定濃度后，系列稀釋至1010-106/μL作為標準品，病毒溶液稀釋10倍取1 μL作為目標模板，U6序列上游引物 ：5′-CGATACAAGGCTGTTAGAG-3′，下游引物 ：5′- TTCAAGTTACGGTAAGCATAT -3′。

1.2.5 rAAV感染體外培養細胞 轉染前1 d，細胞1.5×105個/孔的密度接種于24孔板中。按照1.2.3方法所述，配制含0.5 μg pFastBacDual-ITR-S-T2AEGFP的轉染溶液，用500 μL完全培養基稀釋MOI為105的rAAV-shRNA，替換原來的細胞培養基，然后把質粒轉染溶液滴加在細胞上，72 h后收集細胞進行檢測，rAAV-shRNA/vEGF（靶向無關序列）作為陰性對照。

1.2.6 rAAV-shRNA和S基因表達質粒共同注射小鼠 按照1.2.3方法所述，配制15 μg的pFastBacDual-ITR-S-T2A-EGFP轉染溶液，與含有 Mg2+和 Ca2+的 HBSS中稀釋的1011MOI的rAAV-shRNA混合至總體積90 μL，用移液器取45 μL（總劑量的 1/2）用于鼻內滴注，分兩次完成滴注；或將上述混合液注射到小鼠腿的脛骨前肌中。4 d后犧牲小鼠，收集肺或肌肉組織進行qRT-PCR分析。rAAV-shRNA/vEGF作為陰性對照。

1.2.7 RT-PCR和Western blot鑒定 按照組織總RNA提取試劑盒的說明書所述，提取液氮研磨的組織或細胞中的總RNA，以oligo dT為引物反轉錄獲得 cDNA，具體步驟為 ：7 μL RNA+2 μL 緩沖液+1 μL DNA酶，于 42℃ 孵育2 min，以消化溶液中存在的基因組DNA，然后加入10 μL 2×反轉錄Mix，37℃反轉錄1 h，85℃酶失活5 min。以大約100 ng cDNA為模板進行qPCR檢測，SYBR Green染料法。qPCR引物為：S上游引物5′-CCGTGATCCACAGACACTTGA-3′，S 下游引物 5′- AACAGGGACTTCTGTGCAGT-3′；人 源 actin 上 游 引 物 5′-CGAGAAGATGACCCAGAT -3′，人源actin下游引物5′- GATAGCACAGCCTGGATA -3′；鼠源 actin 上游引物 5′- TTCCAGCCTTCCTTCTTG -3′；鼠源 actin 下游引物 5′- ATAGAGGTCTTTACGGATGTC -3′。

將細胞消化離心后用含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解30 min，15 000×g 4℃條件下離心5 min，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白溶液加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉移至PVDF膜上，一抗為抗S單克隆抗體，二抗為HRP標記山羊抗小鼠IgG，用化學發光成像儀顯影。用強堿性一抗二抗去除液洗去結合的一抗和二抗，再用內參抗體（抗actin單克隆抗體）孵育，其余步驟同上。

1.2.8 統計分析 每組數據至少重復3次。使用 GraphPad Prism 8.0軟 件（GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA）非對稱t檢驗進行統計分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 293T細胞中不同shRNA對S基因表達的抑制

本實驗共設計表達了7條shRNA，為了驗證它們對S基因表達的抑制效應，首先將shRNA的寡核苷酸DNA克隆至U6啟動子下游的表達質粒中，用其與S基因表達質粒共同轉染293T細胞。qRT-PCR結果顯示，除shRNA3對S基因表達無明顯抑制作用外，其余均有顯著的抑制作用，其中shRNA1抑制效應最明顯（圖1-A）。隨后用Western blot進一步驗證，得出的結果與qRT-PCR結果一致（圖1-B）。

圖1 不同shRNA對S基因表達的抑制作用分析比較Fig. 1 Analysis and comparison of the inhibitory effects of different shRNAs on the expression of S gene

2.2 rAAV介導shRNA在體外培養細胞中對S基因表達的抑制

根據2.1結果，篩選出抑制效應最強的shRNA1，將其寡核苷酸序列克隆至AAV包裝質粒中，用于包裝rAAV-shRNA1/S，另外一個對照病毒為實驗室現存的靶向vEGF基因shRNA作為對照。病毒與pFastBacDual-ITR-S-T2A-EGFP質粒共轉染293T細胞分析其對S基因表達的抑制作用。qRTPCR（抑制率為65.6%）和Western blot結果皆顯示其具有顯著抑制S基因表達的作用（圖2）。

圖2 rAAV介導shRNA對S基因表達的體外抑制作用分析Fig. 2 Inhibition analysis of rAAV-mediated shRNA on S gene expression in vitro

2.3 rAAV介導shRNA在小鼠體內對S基因表達的抑制

分別采用滴鼻和肌注方式感染肺臟和肌肉組織，驗證體內對S基因表達的抑制效應。結果皆顯示rAAV介導shRNA在肺臟和肌肉組織中均具有顯著抑制S基因表達的作用，抑制率分別為36.8%和90.3%（圖 3）。

圖3 rAAV介導shRNA對S基因表達的體內抑制作用檢測Fig. 3 Detection of the in vivo inhibitory effect of rAAV-mediated shRNA on S gene expression

3 討論

冠狀病毒（Coronavirus）是一類重要的人畜共患病原體，可引起人、家畜、蝙蝠及其他野生動物的呼吸、胃腸、肝和中樞系統疾病。2003年嚴重急性呼吸綜合征SARS疫情的爆發，在全球共導致8 098例感染，致死率約為10%。2012年，中東呼吸綜合征MERS感染者2 494人，致死率高達34.4%［9-10］。2019年 12月，SARS-CoV-2引 發 的2019冠狀病毒病仍在全球范圍內大流行。至今，冠狀病毒引發的3次重大疫情給人類生命健康造成了巨大的威脅。RNA病毒基因組的易突變特性，加大常規藥物研究的難度。RNAi技術抑制病毒特定基因表達進而影響病毒復制、感染，可能成為一種靈活性高的RNA病毒治療策略。

然而，RNA遞送和穩定性問題是目前有效治療的主要障礙。RNAi治療有兩種遞送系統：第一種，利用脂質體、納米粒子、穿膜肽等非病毒載體直接將體外合成的短干擾RNA（siRNA）遞送至靶細胞。第二種，通過病毒載體遞送siRNA、shRNA和miRNA。基于病毒的天然侵入性，基因工程化的重組病毒系統已被廣泛應用于核酸的跨膜遞送［11］。常用的病毒載體主要包括腺病毒、腺相關病毒、慢病毒和逆轉錄病毒等［12］。與其他病毒載體相比，AAV不會引起任何人類疾病，安全性更高［13］。AAV作為載體的其中一個缺陷是機體預先存在的抗AAV免疫，抑制轉基因的有效穩定表達。為了解決這一問題，可以采用不同血清型連續給藥［14］，或工程化衣殼來解決［15］。

本研究選擇了對肺組織有高親和性的6型AAV作為遞送載體，研究了其介導的shRNA在體外和體內對S基因表達的抑制效率。結果顯示，AAV介導的shRNA能夠顯著地抑制S基因表達。在體內實驗中，shRNA在肺臟和肌肉組織中的抑制率分別為36.8%和90.3%。分析差異比較大的原因可能在于，AAV對不同組織細胞的侵染性不同造成的，也就是說即使相同MOI的rAAV，由于其對肺臟和肌肉的轉導效率差異而導致它在抑制S基因表達時表現出差異性。在本研究中，由于條件限制，我們并沒有涉及活病毒的感染抑制檢測，因此，rAAV介導的shRNA是否能夠高效抑制SARS-CoV-2感染還需要進一步驗證，但根據目前結果我們有理由推測此方法的有效性。

4 結論

本研究構建了rAAV6載體表達靶向SARS-CoV-2 S的shRNA，能夠在體外培養細胞和小鼠體內有效地抑制SARS-CoV-2 S基因的表達。

致謝

感謝山東大學高等醫學研究院王培會教授轉贈SARS-CoV-2 S基因質粒和序列。