冬凌草甲素對急性哮喘小鼠氣道重塑的影響

王興蘭，張建勇

1 遵義醫(yī)藥高等專科學校 貴州遵義 563006 2 遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 貴州遵義 563000

支氣管哮喘（Bronchial Asthma，簡稱哮喘）是由多種細胞和細胞因子共同參與的，以氣道高反應性及氣流受限為主要特征的慢性炎癥性疾病[1]。作為全球最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，哮喘給患者、家庭、社會乃至整個國家?guī)砹顺林氐慕?jīng)濟壓力，已成為危害人類身體和身心健康的主要社會公共衛(wèi)生問題之一[2]。哮喘的發(fā)病機制復雜，尚未完全明確，目前認為氣道重塑和氣道炎癥是哮喘特征性病理改變[3]。1992年Koessler及Huber學者首次提出氣道重塑學說[4]，氣道重塑是哮喘最為典型的病理學特點，涉及炎癥細胞浸潤、新生血管形成、上皮下膠原蛋白的沉積及纖維化以及氣道平滑肌的增生、肥大等[5-7]。長期反復的氣道炎癥是導致哮喘氣道重塑的重要原因，持續(xù)進展的氣道重塑最終可導致氣道阻塞的不可逆、肺功能的嚴重受損以及氣道高反應性的持續(xù)存在[8]。“上皮-間充質(zhì)營養(yǎng)單位學說”是至今較為認可的學說之一，是指由多種炎癥細胞參與引起的炎癥刺激。該學說認為，正常情況下促氣道上皮細胞修復的生長因子與抑制上皮細胞修復、促進纖維增生的細胞因子處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當抑制上皮細胞修復、促進纖維細胞增生的細胞因子處于優(yōu)勢地位時，便會導致氣道上皮細胞無法正常修復，進而導致氣道纖維細胞發(fā)生活化、增生及纖維化，最終引起了氣道重塑[9]。轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor beta，TGF-β）是由上皮細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及成纖維細胞等多種細胞產(chǎn)生，具有抑制氣道上皮細胞的修復、促進纖維細胞增生的功能，是介導哮喘氣道重塑的重要介質(zhì)之一[10]。研究表明哮喘患者支氣管上皮中存在TGF-β1和TGF-β3表達，TGF-β1由肺內(nèi)成纖維細胞等多種細胞產(chǎn)生，在細胞生長、分化、免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，并且是導致氣道重塑的主要介質(zhì)[11-12]。

冬凌草是香茶菜屬植物，冬凌草甲素是從冬凌草中提取出的一種天然化合物，占冬凌有效成分的百分之九十以上，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種功 能[13]，有學者對冬凌草甲素在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用進行研究，陳葉等對雞卵蛋白（ovalbumin， OVA）誘導的哮喘小鼠模型進行研究，結(jié)果表明，冬凌草甲素可通過調(diào)節(jié)輔助性T細胞1型（Th1）/輔助性T細胞2型（Th2）平衡、抑制氣道高反應性來減輕急性哮喘小鼠的炎癥反應[14]。對于冬凌草甲素是否能減輕哮喘小鼠的氣道重塑，國內(nèi)外尚無相關文獻報道，本實驗旨在研究冬凌草甲素對急性哮喘小鼠氣道重塑的影響及可能的機制，為哮喘的診治提供新的思路。

材料與方法

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級6～8周齡BALB/C雌性小鼠，體重（16～20g）（18.11±0.66g），由重慶第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供[SCXK（渝）2012-0005]。

1.2 藥品與試劑 OVA（II級、V級，美國Sigma公司），氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司），冬凌草甲素（上海士豐生物制品有限公司），二甲亞砜（北京中杉生物技術有限公司），實時熒光定量PCR（RT-PCR）引物（TGF-β1、β-actin，大連TaKaRa公司），小鼠抗小鼠-TGF-β1單克隆抗體（英國Abcam公司），二步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉生物技術有限公司），RNAiso Reagent（大連TaKaRa公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa公司），SYBR? GREEN PCR Master Mix（大連TaKaRa公司），馬森（Masson）染色試劑盒（北京索來寶生物科技有限公司），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中杉生物技術有限公司），焦碳酸二乙酯（DEPC）（大連TaKaRa公司），多聚賴氨酸（北京中杉生物技術有限公司），4%多聚甲醛（慶川東化工有限公司），無水乙醇、二甲苯、鹽酸（重慶川東化工有限公司）。

1.3 儀器 自制霧化箱（長27cm×寬24cm×高11cm），壓縮式霧化器NE-C900（歐姆龍大連有限公司），核酸蛋白測量儀ND-1000（美國Nanodrop公司），ICycler iQ5熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司），IPWin32采圖系統(tǒng)DM4000B（德國Lecia公司），Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）。

2 試驗方法

2.1 急性哮喘模型的建立 分別于實驗第1天、第13天，腹腔（40ugOVA+1mg氫氧化鋁）聯(lián)合皮下注射（20ugOVA+1mg氫氧化鋁）致敏。第19～23d，將小鼠放于自制霧化箱內(nèi)，以超聲霧化器進行霧化，10%OVA鹽水氣溶膠吸入激發(fā)，1次/d，每次30min，末次激發(fā)24h后處死小鼠。

2.2 分組給藥 分組：將清潔級雌性BALB/c小鼠隨機分為正常組、模型組、冬凌草甲素10mg/kg干預組（低劑量干預組）、冬凌草甲素20mg/kg干預組（高劑量干預組）。實驗組：致敏過程同模型組，低劑量干預組及高劑量干預組分別于激發(fā)前30min腹腔注10mg/kg及20mg/kg冬凌草甲素。正常組：致敏過程以磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替OVA腹腔聯(lián)合皮下注射，激發(fā)過程以生理鹽水霧化吸入，相關參數(shù)與模型組相同。

2.3 對支氣管壁厚度進行測定 氣道壁厚度測定參照加慧[15]等的方法，氣道壁厚度計算公式：氣道壁厚度（um）=（支氣管總面積—氣道內(nèi)徑面積）/支氣管基底膜的周徑。

2.4 馬森染色（Masson染色）觀察氣道周圍膠原纖維沉積 按照試劑盒說明書進行操作，應用IPWin60彩圖系統(tǒng)及Image-proplus 6.0圖像分析軟件，定量分析氣道膠原纖維陽性相對面積。

2.5 應用免疫組化檢測氣道TGF-β1表達 按照試劑盒說明書進行操作，以PBS代替一抗作空白對照，以小鼠大腸和脾臟分別作陽性和陰性對照，以PBS代替一抗作空白對照，以小鼠大腸和脾臟分別作陽性和陰性對照，以積分光密度（IOD）為指標對各組免疫組織化學染色進行定量分析。

2.6 應用熒光定量PCR檢測肺組織內(nèi)TGFβ1mRNA表達情況 先后完成總RNA的提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、實時熒光定量PCR反應（SYBR Green Ⅱ嵌合熒光法）。TGF-β1引物序列上 游5，-GTGTGGAACATGTGGAACTCTA-3，下 游5，-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3， β-actin引 物序列上游5，-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3，下游5，-CAGCCTGGATGGCTACGTCA -3。

3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS17.0軟件，根據(jù)資料屬性對各組數(shù)據(jù)完成統(tǒng)計，以均數(shù)±標準差表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析進行檢驗，方差齊者使用LSD檢驗，方差不齊者使用Dunnett’s T3檢驗。

結(jié) 果

1 各組小鼠氣道壁厚度

正常組：肺組織的結(jié)構(gòu)正常，氣管平滑肌及基底層無增厚，表面光滑。模型組：杯狀細胞、氣道上皮細胞增生、官腔狹窄、管壁增厚，氣道重塑顯著。干預組：支氣管壁的結(jié)構(gòu)較完整，可見少量平滑肌以及基底層的增厚，且低劑量干預組平滑肌及基底層增厚更明顯。測量氣道壁厚度，干預組、模型組與正常組比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），干預組與模型組比較差異亦具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），高劑量干預組與低劑量干預組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠氣道壁厚度（±s）

表1 各組小鼠氣道壁厚度（±s）

注：與正常組組比較，模型組及干預組P均＜0.01；與模型組組比較，干預組P均＜0.01，與低劑量干預組組比較，高劑量干預組P＜0.01。

組別 氣道壁厚度/μm正常組 36.96±5.08模型組 88.92±10.67低劑量干預組 70.46±9.33高劑量干預組 58.02±6.41

2 Masson染色檢測氣道組織膠原纖維表達情況

模型組、干預組氣道周圍的膠原纖維沉積相對面積均較正常組明顯增高（P＜0.01）。干預組氣道周圍的膠原纖維沉積相對面積均較模型組明顯減少（P＜0.01）。高劑量干預組氣道周圍膠原纖維沉積相對面積均較低劑量干預組顯著減少（P＜0.01）。結(jié)果見表2，圖1-圖4。

圖4 高劑量干預組氣道組織膠原纖維表達

表2 各組小鼠氣道周圍膠原纖維陽性相對著色面積的變化（±s）

表2 各組小鼠氣道周圍膠原纖維陽性相對著色面積的變化（±s）

注：與正常組比較，模型組、干預P均＜0.01；與模型組比較，干預組P均＜0.01，與低劑量干預組比較，高劑量干預組P＜0.01。

組別 氣道周圍膠原纖維沉積相對著色面積/%正常組 4.29±0.65模型組 22.36±1.56低劑量干預組 16.09±1.07高劑量干預組 11.49±0.99

3 免疫組化檢測TGF-β1蛋白的表達情況

應用免疫組織化學染色方法進行檢測TGF-β1在肺組織的表達，TGF-β1主要分布在肺泡巨噬細胞、炎癥細胞、間質(zhì)細胞以及氣道黏膜上皮層。結(jié)果顯示正常組中TGF-β1僅弱表達，而在模型組、干預組中TGF-β1呈陽性表達，測IOD值均較正常組增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組TGF-β1表達較干預組增加（P＜0.01）。低劑量干預組的TGF-β1表達量較高劑量干預組增加（P＜0.01）。結(jié)果見表3，圖5-圖8。

圖5 正常組肺組織TGF-β1

圖8 低劑量干預組肺組織TGF-β1表達

表3 各組小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達（±s）

表3 各組小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達（±s）

注：與正常組比較，模型組、干預P均＜0.01；與模型組比較，干預組P均＜0.01，與低劑量干預組比較，高劑量干預組P＜0.01。

組別 TGF-β1蛋白陽性著色面積正常組 0.07±0.01模型組 0.33±0.02低劑量干預組 0.21±0.01高劑量干預組 0.14±0.01

4 RT-PCR檢測小鼠氣道TGF-β1mRNA的表達

RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA表達，模型組、干預組肺組織中TGF-β1 mRNA的表達量較正常組顯著增加（P＜0.01）。模型組肺組織中TGF-β1 mRNA表達量顯著低于干預組（P＜0.01）；低劑量干預組肺組織中TGF-β1 mRNA的表達量較高劑量干預組顯著增加（P＜0.01）。結(jié)果見表4。圖9-圖12。

圖9 肺組織TGF-β1擴增曲線圖

圖12 肺組織β-actin融解曲線峰圖

表4 各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA相對表達量（±s）

表4 各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA相對表達量（±s）

注：與正常組比較，模型組、干預P均＜0.01；與模型組比較，干預組P均＜0.01，與低劑量干預組比較，高劑量干預組P＜0.01

組別 ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT正常組 5.30±0.11 0±0.11 1.00±0.08模型組 3.71±0.13 -1.60±0.10 3.03±0.24低劑量干預組 3.96±0.13 -1.34±0.06 2.53±0.11高劑量干預組 4.25±0.12 -1.05±0.07 2.08±0.11

圖1 正常組氣道組織膠原纖維表達

圖2 哮喘組氣道組織膠原纖維表達

圖3 低劑量干預組氣道組織膠原纖維表達

討 論

哮喘是全球最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，是一種以氣道阻塞、氣道高反應性及氣道炎癥為主要特征的異質(zhì)性疾病[16]。氣道重塑是哮喘的特征性病理改變，是氣道在長期慢性炎癥反應刺激下發(fā)生的氣道壁結(jié)構(gòu)改變，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可加重哮喘患者的癥狀、降低肺功能[17]。TGF-β1可促進纖維細胞、肌層纖維細胞的增生，是氣道重塑的主要調(diào)控因子之一，與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關[12]。

冬凌草甲素是從冬凌草中提取的貝殼烯二萜類天然有機化合物，既往研究顯示冬凌草甲素具有抗腫瘤、抗增殖、抗炎和抗病毒等作用[18-19]。冬凌草甲素在我國治療炎癥性疾病已有數(shù)百年的歷史，是我國臨床使用最廣泛的中草藥之一。近年來有研究指出，冬凌草甲素可減輕哮喘小鼠氣道炎癥及氣道高反應性[14]，而冬凌草甲素是否能減輕支氣管哮喘的氣道重塑，目前國內(nèi)外暫無相關文獻報道。本實驗通過研究不同劑量冬凌草甲素對OVA誘導的急性哮喘小鼠的影響，采用HE染色觀察氣道壁厚度；Masson染色觀察氣道周圍膠原纖維沉積；免疫組化測定TGF-β1蛋白表達量，RT-PCR測定肺組織中TGFβ1mRNA表達水平。研究結(jié)果顯示，不同劑量的冬凌草甲素均可減輕哮喘小鼠氣道組織膠原纖維的增生、抑制TGF-β1的分泌，且高劑量冬凌草甲素干預組效果明顯優(yōu)于低劑量干預組，存在劑量-效應關系。TGF-β1作為支氣管哮喘產(chǎn)生氣道重塑的主要調(diào)控因子，能促進氣道重塑的發(fā)生。由此推測冬凌草甲素可能通過抑制TGF-β1的分泌來減輕哮喘小鼠的氣道重塑，這一研究結(jié)果或?qū)橄闹委熖峁┬碌乃悸罚l(fā)揮我國中醫(yī)藥的優(yōu)勢，值得進一步深入研究。

圖6 模型組肺組織TGF-β1表達

圖7 低劑量干預組肺組織TGF-β1表達

圖10 肺組織β-actin擴增曲線圖

圖11 肺組織TGF-β1融解曲線圖