哮喘平沖劑對哮喘大鼠肺組織miR-155表達的影響*

唐阿飛，楊莉，張芮，霍正星，周濤

安徽中醫藥大學 安徽合肥 230012

支氣管哮喘（bronchial asthma，簡稱哮喘，asthma）是一種常見的呼吸系統疾病，由一種或者多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病[1]。目前，哮喘發病率在全球呈上升趨勢，在不同年齡，不同人群中均受到影響。哮喘的發病機制目前仍沒有得到明確闡釋，近些年認為遺傳和環境因素共同作用的結果。近年來發現的一類長度為18～22nt的非編碼小分子RNA（ribonucleic acid，miRNA），能夠特異性地降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯[2]。哮喘平沖劑是安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，在臨床使用過程中效果顯著。前期動物實驗表明，哮喘平沖劑在改善大鼠肺功能、氣道炎癥和氣道重塑方面有著重要的作用[3-4]。本實驗通過探討哮喘平沖劑對于哮喘大鼠肺組織miR-155表達的影響，進一步明確哮喘的發病機制，為臨床提供新的診療思路。

資料與方法

1 動物與分組

將60只健康雄性SD大鼠，以每組10只，分為正常對照組（A）、哮喘模型組（B）、桂龍咳喘寧組（C）、哮喘平沖劑高劑量組（D）、哮喘平沖劑中劑量組（E）、哮喘平沖劑低劑量組（F）。動物常規飼養于室溫（25±1）℃環境中，適應7天后進行實驗。

2 觀察指標

2.1 藥物 哮喘平沖劑（蛤蚧8g，麻黃6g，山藥20g，白術10g，木蝴蝶10g，紫蘇子10g，川芎10g）由安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供。桂龍咳喘寧顆粒劑：桂龍藥業（山西）有限公司生產，批號：Z20172117。

2.2 試劑與儀器 卵清蛋白（OVA，美國 Sigma 公司，批號：A5253）；氫氧化鋁：上海東山化工廠；普通PCR儀，杭州晶格科學儀器有限公司，型號：K960；熒光定量PCR儀，Thermo PIKOREAL 96。

2.3 模型制備與給藥方法 A組以生理鹽水致敏和引喘，其余各組腹腔注射10%卵蛋白（OVA）0.5mL致敏，制備CVA模型。于第22天開始用霧化吸入器噴霧1%卵白蛋白（5mL）誘喘20min，1次/d，連續2周，以大鼠出現煩躁不安、打噴嚏、喘鳴、抓耳朵等癥狀為激發成功。哮喘平各劑量組、桂龍咳喘寧組開始給予相關藥物灌胃治療，空白對照組和模型對照組予以生理鹽水灌胃，連續給藥21d。連續灌胃8d。灌胃給藥與霧化激發同步進行。

2.4 取材 加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。4℃ 12000rpm離心15min，取上清（約500ul）加入到另一EP管中。加入0.5mL異丙醇，溫和混勻，室溫放置1min。4℃12000rpm 離心10min，棄去上清。加入1mL75℅乙醇（DEPC水配制）。4℃12000rpm離心5min，棄上清。室溫放置30min干燥RNA沉淀。加入20-50 μL DEPC水， 55℃促溶10min，-80℃保存備用

2.5 熒光定量PCR檢測miR-155的表達 取100mg肺組織，加入1mlTRIzol，提取肺組織總RNA。RNA取反應液200ng作為熒光定量的模板，在10μL反應體系中，加入2×one-step qPCR mix 10μL，Forward primer （10uM）、Reverse primer（10uM）和RT primer（10uM）各0.4μL。反 應 條 件 如 下：95℃10min、95℃10sec、60℃60sec，40個循環。數據采用儀器自帶軟件relative quantification study方法分析，mRNA相對表達量=2-△△Ctx100%。

3 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行處理，結果用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后檢驗采用LSD法，當P＜0.05時，認為差異具有統計學意義。

結 果

1 氣道病理形態學觀察

正常對照組肺組織無炎性細胞浸潤，氣道上皮細胞完整，氣道壁未見明顯增厚；哮喘模型組肺組織有炎性細胞浸潤，氣道上皮細胞不全，管壁狹窄，哮喘平高劑量組和桂龍咳喘寧組較模型組明顯改善，其它組肺組織形態學改變介于哮喘平沖劑高劑量組與模型組之間。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態學比較（HE染色，×400倍）

2 哮喘平沖劑對哮喘大鼠miR-155表達水平的影響

哮喘模型組肺組織中miR-155表達顯著低于正常對照組（P＜0.01）；與哮喘模型組比較，桂龍咳喘寧組、高劑量組、中劑量組、低劑量組肺組織中miR-155表達顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），見表1，圖2。

圖2 哮喘平沖劑對哮喘模型大鼠miR155表達水平的影響（±s， n=10）

表1 哮喘平沖劑對哮喘大鼠miR155表達水平的影響（ ±s， n=10）

表1 哮喘平沖劑對哮喘大鼠miR155表達水平的影響（ ±s， n=10）

注：與正常對照組比較*P＜0.05；與哮喘模型組比較#P＜0.05。

組別 例數 miR155正常對照組 10 1.00±0.14哮喘模型組 10 0.08±0.01*哮喘平高劑量組 10 0.54±0.06#哮喘平中劑量組 10 0.43±0.05#哮喘平低劑量組 10 0.11±0.00#桂龍咳喘寧組 10 0.17±0.02#

討 論

目前認為哮喘是由一種因素導致的慢性氣道炎癥性疾病。其主要的病理特點為氣道炎癥和氣道重塑。哮喘的發病機制不完全清楚，但近年來研究發現，基于離子通道和信號通路干預氣道重塑進程在哮喘發病機制中起重要作用[5-6]。吸入型糖皮質激素是目前首選的控制氣道炎癥、改善氣道阻塞的藥物， 早期應用可有效地改善肺功能和氣道阻塞， 但激素對肺功能和氣道阻塞的改善作用并不能代表其能夠抑制氣道重塑[7-8]。中醫學認為哮喘的病因病機在于先天稟賦不足和外感六淫之邪侵襲所致[9-11]。中醫藥在治療哮喘有著獨特優勢。閆云霞[12]在治療哮喘方面運用柴胡滲濕湯，發現柴胡滲濕湯通過抑制TGF-β1的表達來改善哮喘氣道炎癥和氣道重塑。宣桂琪[13]通過氣陰雙補方發現中藥復方能夠減輕氣道平滑肌，降低肺組織中TGF-β1mRNA。張念志教授基于哮病“虛-瘀-痰”理論，運用益氣活血化痰之法擬方哮喘平沖劑治療支氣管哮喘，臨床應用二十余年床效果 頗佳[14]。

該方中山藥益肺養陰，補腎健脾，蛤蚧補肺益腎，納氣定喘，助陽益精，兩者聯用為君藥。白術健脾益氣，利水滲濕為臣藥輔之。麻黃發汗解表，宣肺平喘，木蝴蝶可清肺熱，利咽喉、紫蘇子降肺氣，化痰涎，三者共用佐藥宣肺利肺，止咳平喘，全方結構嚴謹，切中病機，標本兼顧，共奏益氣、活血、化痰、止咳之效。

項目組既往研究表明，哮喘平沖劑能明顯改善哮喘癥狀和肺功能[15]，通過調節嗜酸性粒細胞（EOS）和嗜酸細胞陽離子蛋白（ECP），抑制TNF-α、IL-4、IL-17的表達而減輕哮喘的高反應性和氣道炎癥[4，16]。另外，哮喘平沖劑能夠通過抑制Bcl-2和促進Bax二者之間的表達水平和調節MMP-9/TIMP-1的平衡，減輕哮喘氣道重塑，改善哮喘癥狀[4，17，18]。為進一步探究哮喘平沖劑干預哮喘的分子機制，項目組首次以miRNA作為評價指標，或許為闡明哮喘的發病機制提供新的思路。

miRNA是一種長度為18～22個nt，具有高度特異性的單鏈小分子非編碼RNA，廣泛參與細胞的生長，發育，繁殖，對于免疫系統也有著重要作用[19-20]。近些年認為miRNA可能在哮喘的發病中起到重要作用。Lu[21]等認為，miR-21在調節哮喘Thl/Th2機制中有著重要的作用。Dragon[22]等發現在哮喘患者肺組織中高表達的miR-26a、miR-200c、let-7b、miR-16和miR-125b，可能是參與調控氣道及肺組織相關基因表達的miRNA。miR-133、miR-25、miR-146a和miR-26a的機制是通過改變炎性因子（如IL-1β、TNF-α、IFN-γ）的表達[23]。在哮喘發生發展過程中miR155能夠影響炎性因子的表達（IL-35，IL-6），也能夠調控IL-13的通路，調節T細胞向T1分化[2]。因此推測miR-155在哮喘發病過程中有著重要的作用[24-25]。miR-155的表達水平降低可導致哮喘炎癥細胞因子表達增多，氣道重塑加重[26]。也有學者指出來RNA的異常表達可能會增加哮喘的嚴重度[27]。

本研究中哮喘模型組大鼠miR-155的相對表達量較正常對照組明顯減少（P＜0.01），說明造模成功。其中，哮喘平高、中劑量組與桂龍咳喘寧組相比，可顯著升高大鼠miR-155相對表達量（P＜0.01），說明哮喘平高、中劑量效果優于上市中藥制劑桂龍咳喘寧，提示哮喘平沖劑高、中劑量可有效增強miR-155的相對表達量，減輕炎癥反應和哮喘癥狀。

綜上所述，哮喘平沖劑能直接或間接上調miR-155的相對表達量，提高機體的保護機制，最終達到緩解氣道炎癥和阻止氣道重塑進程的效果，這可能為臨床治療哮喘提供了新思路。