肉桂醛調控CD44s/STAT3信號通路抑制胰腺癌細胞增殖和腫瘤細胞干性

朱素麗，陳運昊，姚尖平，周興旺

(中山大學 1.中山醫學院生化與分子生物學教研室、 2.附屬第一醫院檢驗科、 3.附屬第一醫院心外科， 廣東 廣州 510080)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)惡性程度高，預后極差，具有發病隱匿、早期診斷困難、進展快、轉移早等特點，5年整體生存率不到10%[1]。2020年的數據統計表明，胰腺癌全球范圍內的發病人數為49.6萬，而死亡人數就已經達到46.6萬，幾乎與發病人數相當，已經成為癌癥死亡的第7大原因[2]。目前，手術切除是唯一可能的治愈手段，但僅20%的患者可接受手術，且超過80%的患者術后復發。大部分患者發現病情時已發生轉移，而對于晚期患者，主要采取的是全身化療聯合方案，但這也僅將患者的生存期延長6～12個月[3]。已有許多研究表明，腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)是導致PC易轉移復發和易耐藥的重要原因[4]。因此，研究發展不僅能夠抑制普通胰腺癌細胞，更能有效抑制胰腺癌干細胞的新治療策略至關重要。

肉桂醛(cinnamaldehyde，CA)是主要來源于樟科植物肉桂的一種醛類化合物，為黏稠狀黃色液體，自然界存在的肉桂醛均為反式結構。現有研究表明，肉桂醛具有防治糖尿病、抑菌、抗病毒、抗癌等多種藥理活性，尤其是在抗結直腸癌方面，具有抑制細胞增殖、誘導凋亡、逆轉上皮間質轉化等作用[5]，被認為是一種具有抗癌活性的天然分子。然而CA是否也能抑制胰腺癌生長尚不清楚。

CD44作為細胞外成分的重要受體，廣泛參與腫瘤細胞黏附、增殖、遷移等過程，在胰腺癌中，CD44的標準亞型即CD44s與腫瘤細胞干性密切相關，CD44s高表達被認為具有促進腫瘤轉移復發的作用，可作為胰腺癌細胞干性標志物[6]。轉錄激活因子3(STAT3)在調節癌細胞生長和存活方面至關重要，CD44s可激活STAT3的磷酸化，維持腫瘤干細胞自我更新和多向分化潛能，因此，抑制CD44s/STAT3信號通路是抑制胰腺癌生長和干性的途徑之一[7]。本研究首次發現肉桂醛可顯著抑制胰腺癌細胞PANC-1的生長增殖，在此基礎上還研究了其對胰腺癌細胞干性的抑制作用，以及對相關的CD44s/STAT3信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 胰腺癌細胞PANC-1購自 American Type Culture Collection(ATCC)。

1.1.2藥物與試劑 反式肉桂醛，購于上海源葉生物有限公司(批號H02M6Q1，檢測純度≥99%)；高糖DMEM細胞培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素購于美國Thermo 公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑)購于日本同仁研究所(Dojindo)；1%結晶紫(批號V5265)、DMSO(批號D2650)購于美國Sigma公司；CFSE染色試劑盒(批號C34554)購于美國Invitrogen；EGF(批號78016)、b-FGF(批號78003.1)、B27(批號05711)、ALDEFLUORTMKit(批號01700)以及DMEM/F12干細胞培養基(批號36254)購于加拿大干細胞技術有限公司(STEMCELL Technologies)；PrimeScriptTMRT Master Mix(批號RR036A)和TB GreenTMPremix Ex TaqTM(批號RR420A)購于日本TaKaRa；流式抗體APC-CD24和PE-CD44購于北京BioLegend生物科技有限公司；一抗抗體Nanog(批號4903)、Sox-2(批號3579)、Oct-4(批號2750)、GAPDH(批號5174)、p-STAT3(批號9145)、STAT3(批號9139)及CD44s(批號3540)均購于美國Cell Signaling Technology(CST)，山羊抗鼠二抗(批號SA00001-2)和山羊抗兔二抗(批號SA00001-1)購于中國Proteintech；STAT3激活劑Colivelin TFA(批號HY-P1061A)購于美國MedChemExpress生物科技公司。

1.1.3儀器 CO2恒溫細胞培養箱(美國Thermo)；酶標儀(瑞士TECAN)；圖像掃描機分析軟件(美國Bio-Rad)；研究級倒置熒光顯微鏡(德國Leica)；10色分析型流式細胞儀(美國Beckman)；超微量紫外、可見光分光光度計(美國Thermo)；實時熒光定量PCR系統(美國Bio-Rad)；Western blot電泳儀器、轉印槽及化學發光成像系統(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 胰腺癌細胞系PANC-1細胞培養于含10% FBS、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、5% CO2培養箱常規培養，每隔2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細胞存活率 將對數生長期的PANC-1細胞懸液濃度調整為6×107個·L-1，接種于96孔板，每孔100 μL(6 000個細胞/孔)，d 2待細胞貼壁后，用遞增濃度的CA(0、5、15、20、30、50、70、100、150 μmol·L-1)進行處理，每個藥物濃度設置3個復孔，分別繼續培養24、48或72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于37℃、5% CO2培養箱孵育45～60 min，使用酶標儀在450 nm 處測量吸光度(OD)值；分別計算3個時間段的細胞生長抑制率，生長抑制率/%=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3CFSE染色實驗 將對數生長期的PANC-1細胞消化收集，加入Cell TraceTMCFSE染料(5 μmol·L-1)，37 ℃避光孵育15 min，加入完全培養液中和5 min，離心收集染色細胞，常規培養，用于后續實驗驗證，流式收集分析數據。

1.2.4克隆形成實驗 將對數生長期的PANC-1細胞制備成濃度為4×105個·L-1的單細胞懸液，均勻的接種于6孔板中，每孔加入2 mL(800個細胞/孔)，設置空白溶劑對照組、CA低濃度組(8 μmol·L-1)及CA高濃度組(16 μmol·L-1)；處理48 h后將培養基更換為無藥物的完全培養液，繼續培養10 d后，甲醇固定15 min，0.5% 結晶紫染色，風干后拍照并進行統計分析。

1.2.5干細胞懸浮成球實驗 制備含有EGF(20 μg·L-1)、bFGF(20 μg·L-1)、B27(10 μg·L-1)的DME:F12干細胞培養液，分別用含有指定濃度CA(0、8、16 μmol·L-1)的干細胞培養基重懸細胞，將濃度調整為2.5×106個·L-1，接種于超低黏附6孔板，每孔2 ml(5 000個細胞/孔)，每組設置3個復孔，繼續培養7 d后，使用倒置顯微鏡對單個球體進行拍照、計算球體數目并進行統計分析。

1.2.6實時熒光定量PCR檢測干性基因表達 將對數生長期的PANC-1細胞接種于6孔板，貼壁后用指定濃度的CA(0、8、16 μmol·L-1)處理48 h，隨后每孔加入1 mL TRIzol 試劑，提取細胞總RNA，使用超微量紫外分光光度計進行純度檢測及含量測量、瓊脂糖電泳確定RNA完整性，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行熒光定量PCR反應，具體操作根據PrimeScriptTMRT Master Mix和TB GreenTMPremix Ex TaqTM的試劑盒說明書進行。實驗結果根據相對定量方法進行分析，計算2-ΔΔCt值，比較藥物處理組與空白溶劑組之間檢測基因的表達差異是否具有統計學意義。

1.2.7流式細胞術檢測CD44+CD24+細胞比例 將對數生長期的PANC-1細胞接種于6孔板，貼壁后加入指定濃度的CA處理48 h，胰酶消化，用4 ℃預冷的PBS洗滌兩次，將細胞濃度調整為1×106個/100 μL后，將APC anti-human CD24抗體和PE anti-human CD44抗體以1 ∶40的比例加入100 μL細胞懸液中，4 ℃避光染色45 min，離心去上清，預冷PBS洗滌兩次，流式上機檢測CD44+CD24+亞群比例，用Flow Jo軟件對數據進行分析。

1.2.8流式細胞術檢測ALDH+細胞比例 將經不同處理后的PANC-1細胞收集，4 ℃預冷PBS洗滌兩次，預先將5 μL DEAB加入至陰性對照管中，用ALDEFLUORTMAssay Buffer調整細胞濃度為1×109個·L-1，隨后添加5 μL活化的ALDEFLUORTM至1 mL細胞懸液中，混合并立即將0.5 mL混合物轉移到陰性對照管，避光孵育30 min，離心去上清，流式上機檢測ALDH+比例并做統計分析。

1.2.9Western blot檢測相關蛋白表達 使用指定濃度的CA處理PANC-1細胞48 h，加入適量含蛋白酶、磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl, pH 7.6, 150 mmol·L-1NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40)，置于冰上震蕩裂解20 min后，4 ℃、1 2000 r·min-1離心15 min，取上清，用BCA試劑盒對蛋白濃度進行檢測，加入蛋白緩沖液，100 ℃加熱變性10 min。蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，隨后轉移到PVDF膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，對應一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，HRP標記山羊抗兔/鼠二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL發光液在化學發光儀上進行顯色，采集圖像。

2 結果

2.1 CCK-8檢測CA對胰腺癌細胞存活率的影響CA結構式如Fig 1A所示，用遞增濃度的CA分別處理PANC-1胰腺癌細胞24、48及72 h，實驗結束點加入CCK-8試劑對細胞存活率進行檢測。如Fig 1B所示，CA可明顯降低PANC-1細胞的存活率，作用呈濃度和時間依賴性，其中CA處理下PANC-1細胞對應的IC50值在24 h為114.67±6.21 μmol·L-1、在48 h為16.57±1.10 μmol·L-1、在72 h為12.77±0.12 μmol·L-1。

Fig 1 Effects of CA on cell viability of pancreatic cancer PANC-1 cells n=3)

2.2 CA抑制胰腺癌PANC-1細胞的增殖能力CFSE是一種可對活細胞染色的熒光染料，其熒光強度會隨著細胞增殖而逐級遞減。如Fig 2所示，與空白對照相比，CA處理后，細胞的熒光強度明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.01)，表明CA可明顯抑制PANC-1細胞的增殖能力。

Fig 2 Effects of CA on proliferation of pancreatic cancer PANC-1 cells n=3)

2.3 CA抑制PANC-1癌細胞的克隆形成能力為了進一步探究CA對單個胰腺癌細胞增殖能力的影響，采用平板克隆形成實驗進行研究。用CA(0、8、16 μmol·L-1)處理細胞48 h后，繼續用無藥物培養基培養至克隆長到肉眼可見大小，固定染色。如Fig 3所示，CA呈劑量依賴性使克隆體積變小，數量變少，在高濃度藥物處理組(16 μmol·L-1)，細胞的克隆形成能力幾乎被完全抑制。

Fig 3 Effects of CA on colony formation of

2.4 CA抑制胰腺癌PANC-1細胞的干細胞成球能力干細胞懸浮成球能力是反映腫瘤干性的一項重要指標，腫瘤干細胞可耐受無血清培養基環境，而普通的腫瘤細胞在此環境中逐漸死亡，單個的腫瘤干細胞繼續生長形成干細胞球。如Fig 4所示，CA可明顯抑制胰腺癌細胞在無血清懸浮培養體系中的成球能力，使球體體積減小，數量變少。

Fig 4 Effects of CA on sphere-forming ability in suspension culture of PANC-1 cells n=3)

2.5 CA抑制胰腺癌腫瘤干細胞相關基因的表達水平用指定濃度的CA處理PANC-1細胞48 h后，分別提取總RNA和總蛋白對干性相關基因Nanog、Sox-2及Oct-4的表達水平變化進行檢測分析。如Fig 5A所示，在qRT-PCR結果中，與空白對照組相比，CA可呈濃度依賴性的抑制3種腫瘤干細胞相關基因的mRNA表達，結果具有統計學意義(P<0.05)；同樣，Western blot結果也表明，CA在蛋白水平對干性基因的顯著抑制作用(Fig 5B)。

Fig 5 Effects of CA on stemness-related gene expression in PANC-1 cells n=3)

2.6 CA減少PANC-1癌細胞的CD44+CD24+干細胞亞群比例CD44+CD24+亞群是胰腺癌干細胞亞群之一，具有胰腺癌干細胞特性。用不同濃度的CA作用PANC-1細胞48 h后，對細胞進行CD44和CD24抗體染色，流式細胞術檢測CD44+CD24+比例。如Fig 6所示，CA處理可減少細胞中的CD44+CD24+比例，差異具有統計學意義(P<0.01)。

Fig 6 Effects of CA on CD44+CD24+proportion in PANC-1 cells n=3)

2.7 CA減少PANC-1癌細胞的ALDH+干細胞亞群比例ALDH+亞群是另一重要的胰腺癌干細胞亞群。如Fig 7所示，CA作用48 h后，PANC-1的ALDH+細胞比例明顯下降，且效果隨濃度的升高進一步加強。

Fig 7 Effect of CA on ALDH+ proportion

2.8 CA對PANC-1癌細胞CD44s/STAT3通路的影響CD44是胰腺癌細胞干性相關的表面標志物之一，其中CD44s亞型與胰腺癌細胞干性功能密切相關，可使下游的信號分子STAT3磷酸化激活。如Fig 8A所示，CA可抑制CD44s的表達，同時，STAT3的磷酸化激活被抑制，而總STAT3表達幾無變化；進一步采用STAT3激動劑Colivelin進行回復驗證，發現當STAT3磷酸化增強后(Fig 8B)，CA的抑制作用被部分回復(Fig 8C、D)，提示CA可能通過調控CD44s/STAT3通路抑制PANC-1細胞的增殖和腫瘤細胞干性。

Fig 8 Pancreatic PANC-1 cell proliferation and stemness affected by CA via CD44s/STAT3 pathway n=3)

3 討論

胰腺癌惡性程度高，預后極差，目前主要靠手術或化療控制癌癥進展，但由于發病隱匿，轉移早，多數病人發現時已失去手術機會，只能采用全身治療方案：5-氟尿嘧啶、葉酸、伊立替康和奧沙利鉑四聯方案(FOLFIRINOX)或吉西他濱聯用紫杉醇[8]；然而，這些治療手段并未改變胰腺癌易轉移復發、易耐藥的治療困境，也未能有效延長病人的生存時間，因此，研究發展新的安全有效的治療策略非常重要。胰腺癌的發生發展非常復雜，一些癌癥相關基因的改變會對胰腺癌進程產生影響，其中Kras是在胰腺癌中突變非常普遍的原癌基因，在早期就已出現，且參與胰腺癌生長、分化及轉移過程[9]，因此我們選擇了攜帶Kras突變的胰腺癌細胞株PANC-1進行了研究。

從天然產物中挖掘活性成分是現代新藥研發的重要途徑之一。CA是主要來源于肉桂的天然產物，目前已被證明具有較為廣泛的抗腫瘤作用，主要是通過抑制腫瘤細胞增殖、誘發凋亡發揮抗腫瘤效果，天然分子抑制細胞增殖是經典的抗胰腺癌研究方向之一[10]。已有研究表明，CA可通過PI3K/AKT通路抑制腸癌細胞的增殖和轉移，誘導腸癌細胞凋亡[11]；還可以通過Wnt/β-catenin通路誘導非小細胞肺癌發生凋亡，逆轉上皮間質轉化[12]。然而CA在胰腺癌的研究尚未見有研究報道。

本文首先通過CCK-8實驗發現CA對PANC-1胰腺癌細胞存活率有顯著影響，并進而通過CFSE細胞增殖熒光染色實驗進一步證實了CA顯著抑制PANC-1癌細胞的增殖，此外，克隆形成實驗可反映癌細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要特性，我們的結果表明CA還可顯著抑制PANC-1癌細胞的克隆形成能力。說明天然產物CA可抑制胰腺癌細胞PANC-1的生長增殖。

腫瘤干細胞(CSCs)是腫瘤中占比非常小的一個亞群，1997年首次在急性白血病中發現[13]，隨后在越來越多的腫瘤中被證實，胰腺癌干細胞(pancreatic cancer stem cells，PCSCs)在2007年被分離證實，研究者發現與普通腫瘤細胞相比，PCSCs具有更強的致瘤性、無限增殖能力及多向分化潛能，因此不易被清除，被認為是導致腫瘤發生、耐藥及轉移復發的重要原因之一[14]。現階段針對PCSCs的研究主要是通過靶向PCSCs的表面標志物、靶向PCSCs的調控通路或誘導PCSCs分化來抑制PCSCs的生長，如采用單克隆抗體與表面標志物的結合來達到抗胰腺癌作用的CD44單抗；使用mTOR通路抑制劑雷帕霉素、SHH通路抑制劑聯用吉西他濱也可有效抑制清除PCSCs，改善腫瘤復發轉移和耐藥[15]。然而臨床上胰腺癌治療目前仍缺乏針對PCSCs的安全有效藥物，不僅如此，已有多項研究表明，臨床使用的胰腺癌一線治療藥物吉西他濱還會增強胰腺癌的干性造成耐藥[16]，因此，研究發展能夠抑制PCSCs的新治療方略至關重要。本研究發現CA可抑制PANC-1胰腺癌干細胞的懸浮成球能力，可顯著抑制胰腺癌干細胞干性相關的3種基因Nanog、Sox-2及Oct-4的表達水平；此外，通過流式檢測細胞中2種不同的干細胞亞群(CD44+CD24+細胞和ALDH+細胞)比例，還發現CA可呈濃度依賴性的減少胰腺癌細胞的干細胞比例，上述結果都表明CA對PANC-1腫瘤細胞干性的抑制作用。

PCSCs的調控機制是非常復雜的，涉及多條信號通路的參與如SHH、Notch1、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR信號通路，CD44s/STAT3通路已被證實對胰腺癌增殖和干性的維持意義重大。研究表明采用單克隆抗體抑制CD44s可使下游的Nanog/Sox-2干性基因及p-STAT3被抑制，從而抑制胰腺癌的增殖和干性[8]；與CD44-CD24-和ALDH-細胞相比，CD44+CD24+和ALDH+胰腺癌干細胞亞群的STAT3通路被異常激活，抑制STAT3通路可顯著抑制胰腺癌細胞干性[17]。然而，由于成體干細胞等也表達CD44s，采用抗體治療的策略可能會對正常干細胞產生傷害，且單克隆抗體價格昂貴，目前臨床上也尚無成功上市的STAT3抑制劑，因此，仍需繼續研究發現針對CD44s/STAT3信號通路的安全性好的新藥物；而CA為傳統中藥單體，可作為食用香料使用，安全性較好。我們采用Western blot對CD44s/STAT3通路相關蛋白進行檢測，結果發現，CA可降低p-STAT3和CD44s的表達，而STAT3蛋白表達幾無變化，為進一步驗證，我們采用STAT3的特異激動劑Colivelin TFA[18]進行回復實驗，發現增強STAT3的磷酸化水平可部分回復CA對PANC-1細胞增殖和干性的抑制效果，說明CA可能通過CD44s/STAT3通路抑制PANC-1細胞的增殖和干性。

綜上，CA可抑制胰腺癌細胞的增殖和腫瘤細胞干性，減少胰腺癌干細胞比例，其機制可能與調控CD44s/STAT3信號通路有關。后續研究將利用體內動物模型和臨床樣本繼續對此深入探討，為發展相關的胰腺癌新治療藥物提供更多科學依據。