沒藥甾酮下調PXR/P-gp通路逆轉肝癌化療耐藥機制

夏黃帥，余卓倫，張其海，王 娟，許婉婷，徐宏彬,,3

(1．南京醫科大學上海十院臨床醫學院，江蘇 南京 211166；2．南京中醫藥大學第二附屬醫院科教處，江蘇 南京 210017； 3. 同濟大學醫學院上海市第十人民醫院藥學部，上海 200072)

肝癌是東亞國家發病率最高的癌癥之一，占所有癌癥的7%，而超過90%的原發性肝癌屬于肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。在我國，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染，飲食攝入黃曲霉素和農村地區飲用水污染是引發肝癌的高危因素[2]。HCC特點是高死亡率、高復發率、高轉移率和不良預后。常用化療藥物中包括5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、鉑類抗腫瘤藥如順鉑(cisplatinum，DDP)[3]。5-FU是胸腺嘧啶合成酶抑制劑，通過錯誤插入DNA和RNA，使胸腺嘧啶合成酶失活，從而抑制DNA的合成，導致腫瘤細胞死亡[4]。DDP抗腫瘤的作用機制是與DNA單鏈或雙鏈交叉連接，導致DNA模板缺陷和DNA合成和復制終止[5]?；熓歉伟┚C合治療的手段之一，對部分患者有效，但由于化療藥物多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)的產生，其治療結果仍不理想[6-7]。

腫瘤細胞中多藥耐藥基因1(MDR1)的過度激活和其轉錄產物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp/ABCB1/MDR1)表達的顯著提高是腫瘤多藥耐藥產生的主要原因之一[6]；P-gp是一種跨膜轉運蛋白，利用ATP水解產生的能量將藥物轉運出細胞膜；已知DDP、5-FU是P-gp轉運的底物[7-8]。孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)是一種配體激活的轉錄調控因子，一個控制藥物Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶表達的核內受體。肝癌細胞中PXR激活后，誘導MDR1基因轉錄、增強P-gp表達，是肝癌化療產生獲得性多藥耐藥的重要機制[6, 9]。維拉帕米、環孢素等腫瘤耐藥逆轉劑由于毒副作用大，限制了其臨床應用[10-11]，因此，從天然藥物中選取高效、低毒的單體化合物逆轉PXR/P-gp介導的肝癌耐藥，對改善肝癌化療療效具有重要意義。

沒藥是橄欖科植物地丁樹(CommiphoraMyrrhaEngl.)和哈地丁樹(CommiphoraMolmolEngl.)的干燥樹脂，沒藥甾酮(guggulsterone，GS)是從沒藥脂中分離出的植物甾醇，是沒藥主要活性成分，包含Z和E兩種同分異構體(含量比約3/1)，其中Z構型在抗腫瘤中發揮主要作用[12]。我們前期研究發現，沒藥甾酮通過調控P-gp表達和轉運功能，能增強化療藥物對腫瘤細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用[13]。沒藥甾酮能否通過調控PXR/P-gp介導的肝癌多藥耐藥，改善其化療療效，目前尚未研究。本實驗將對此進行研究。

1 材料與方法

1.1 細胞人源肝癌HepG2細胞，購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物與試劑Z-沒藥甾酮(Z-guggulsterone，Z-GS，>98%，3134716)、順鉑(cisplatin，DDP, >99%，PHR1624)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU, 99.0%～101.0%, WXBC9054V)、利福平(rifampicin，RFP，≥97%, R3501)、酮康唑(ketoconazole，KTZ，≥98%，SLBR1290V)、二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO，SHBM4129)、PI(protease inhibitor cocktail，P8340)、BSA(fetal calf serum，12003C) 、β-actin(IPSC1030)(美國sigma公司)；MEM(minimum essential medium，8119457)培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，12106C)、雙抗(青霉素、鏈霉素, A5955)、2.5%胰酶(trypsin, 1494079,美國Gibco公司)、PBS(GC19KA8119,上海生工公司)、CCK-8(Cell Counting Kit-8，PN534)(日本同仁化學科技有限公司)、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒(美國eBioscience公司, 225239-000)、BCA試劑盒(NA168202)(美國Thermo Fisher 公司)、SDS-PAGE上樣緩沖液(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺，上海碧云天生物技術有限公司, 030620200610)、MDR1(美國Cell Signaling Technology公司, 2)、PXR(英國Abcam公司，GR3311698-2)、HRP-R(2311797)、HRP-M(1670013)(美國Jackson公司)、ECL化學發光超敏顯色試劑盒(S7017030)、qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox,H8001160,上海翊圣生物科技有限公司)；TRIzol(美國Invitrogen公司，235002)；PrimeScript RT regent Kit(AI51090A,日本TaKaRa公司)

1.3 儀器細胞培養箱、Nanodrop 2000微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；DMI 6000B倒置顯微鏡(德國Leica公司)；Synergy2多功能酶標儀(美國BioTek公司)；ABI Q-DX熒光定量 PCR儀(美國ABI公司)；7900HT FAST Real-time PCR儀(德國Eppendorf公司);FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(美國BD Bioscience公司)；AI600化學發光成像儀(美國通用公司)。

1.4 細胞培養與試劑配制人肝癌細胞株HepG2用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的MEM完全培養基培養，培養箱溫度為37 ℃、5% CO2。細胞生長至密度為70%～80%時，用1×PBS清洗細胞，用0.25%胰酶(不含EDTA)于37 ℃培養箱內消化至鏡下觀察胞質回縮，以1/4～1/3的比例傳代。各藥物用DMSO溶解成母液，使用時在MEM完全培養基中稀釋成所需濃度(最終DMSO<1‰)。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖將處于對數生長期的細胞按6 000個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL細胞懸液，放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，分為對照組和實驗組。實驗組分別用Z-GS(1、3、10、30、100、200、400 μmol·L-1)單藥處理細胞24、48、72 h；DDP(1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)單藥、5-FU(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1)單藥及聯合Z-GS(30 μmol·L-1)處理細胞24 h，每個濃度設6個復孔，每組實驗獨立重復4次。處理后每孔加入培養液體積10%的CCK-8試劑，在37 ℃、5% CO2培養箱內反應1.5 h，用酶標儀檢測每孔450 nm處吸光度(A)，將每組吸光度求平均值，使用均值計算細胞存活率。存活率/%=(A對照組-A實驗組)/(A對照組-A實驗組) ×100%。

1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡取對數生長期細胞，按2×104個/孔種于24孔培養板中，每孔1 mL完全培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，分為對照組和實驗組。實驗組分別用DDP(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)單藥、5-FU(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 mmol·L-1)單藥及聯合Z-GS(30 μmol·L-1)處理24 h。收集各孔培養液中的懸浮細胞，用0.25%胰酶消化每孔貼壁細胞并用完全培養基終止消化后合并。用PBS清洗2次，加入100 μL Binding buffer和FITC標記的Annexin-Ⅴ(20 mg·L-1)5 μL，室溫避光15 min，再加入PI(50 mg·L-1)5 μL，避光反應5 min，加入400 μL Binding buffer，同時以不加Annexin-Ⅴ FITC/PI的一管作陰性對照。用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，各組實驗獨立重復3次。使用FACSDIVA軟件分析結果。

1.7 RT-qPCR法檢測mRNA表達取對數生長期細胞，按1.5×105個/孔接種于12孔板，每孔1 mL完全培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，分為對照組和實驗組。實驗組分別用不同濃度Z-GS(10、30、100、200 μmol·L-1)，DDP(50 μmol·L-1)、5-FU(2.5 mmol·L-1)單藥及聯用Z-GS(30 μmol·L-1)處理24 h。根據TRIzol Reagent說明書抽提總RNA，使用微量分光光度計測定RNA濃度和純度，A260/A280值均在1.8～2.0之間。根據PrimeScript RT reagent Kit說明書逆轉錄RNA，反應條件為：37 ℃ 15min，85 ℃ 5s，cDNA儲存于-20 ℃。根據SYBR Green Master Mix (High Rox)說明書進行實時熒光定量反應，qPCR反應體系為10 μL，反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。引物序列如下：MDR1上游引物：5′-GGGAGCTTAACACCCGACTTA-3′,下游引物：5′-GCCAAAATCACAAGGGTTAGCTT-3′; GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。所有實驗獨立重復3次，結果以Ct值表示，目的基因MDR1相對于內參基因GAPDH的表達量用2-ΔΔCt表示。

1.8 Western blot法檢測蛋白表達取對數生長期的細胞，3×105個/孔接種于6孔板，每孔2 mL完全培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，分為對照組和實驗組。實驗組分別用不同濃度Z-GS( 3、10、30 μmol·L-1)、DDP(25、50、100 μmol·L-1)單藥、5-FU(1.25、2.5、5 mmol·L-1)單藥、KTZ(40 μmol·L-1)和RFP(30 μmol·L-1)以及聯用Z-GS(30 μmol·L-1)處理24 h。使用含1%PI的2×loading冰上提取總蛋白，BCA法測定各組蛋白樣品濃度，加入SDS-PAGE并加熱10 min使蛋白變性。按每個樣品40 μg蛋白總量進行SDS-PAGE凝膠電泳，待目的蛋白分離后于冰水浴條件下將蛋白轉移至NC膜，以5%BSA為封閉液室溫搖床封閉1 h，將一抗用封閉液稀釋后(β-actin：1 ∶1 000、P-gp：1 ∶1 000、PXR：1 ∶200)，于4 ℃避光孵育過夜。次日用含0.1% Tween 20的PBST洗膜3次，每次10 min，二抗用封閉液稀釋后(HRP-R：1 ∶1 000、HRP-M:1 ∶1 000)，室溫避光孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min。通過ECL化學發光法得到目的蛋白條帶，β-actin為內參，圖像使用Image Studio分析。每組實驗獨立重復5次。

2 結果

2.1 Z-GS顯著增強DDP和5-FU對HepG2增殖抑制作用與對照組相比，100、200、400 μmol·L-1Z-GS處理細胞24 h后，細胞存活率分別為88.37%、79.46%、60.24%，明顯抑制HepG2細胞增殖(P<0.05，Fig 1A)；24 h Z-GS(≤30 μmol·L-1)對HepG2細胞增殖幾乎無影響(P>0.05)，所以選擇Z-GS(30 μmol·L-1)與化療藥物聯用進行后續實驗。3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1DDP單獨處理細胞24 h細胞存活率分別為97.18%、94.59%、81.11%、 70.79%、56.91%、40.95%、29.42%，與Z-GS(30 μmol·L-1)聯用后細胞存活率分別為83.93%、83.29%、74.65%、52.93%、36.52%、30.39%、26.77%；0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-15-FU單獨處理細胞24 h細胞存活率分別為95.26%、92.54%、84.64%、79.16%、65.77%、43.31%、23.58%，與Z-GS(30 μmol·L-1)聯用后為88.90%、85.50%、77.78%、70.21%、54.49%、36.72%、17.67%。結果表明，與DDP、5-FU單藥組相比，聯用Z-GS(30 μmol·L-1) 明顯增強化療藥物對HepG2細胞的增殖抑制作用(P<0.05,Fig 1C,D)。

2．2 Z-GS顯著增強DDP和5-FU對HepG2細胞凋亡誘導作用與對照組相比，24 h Z-GS(30 μmol·L-1)對HepG2細胞凋亡幾乎無影響；DDP(12.5、25、50、100 μmol·L-1)處理HepG2細胞24 h后顯著促進HepG2細胞凋亡，與Z-GS(30 μmol·L-1) 聯用后，進一步增加DDP對HepG2細胞凋亡誘導作用，凋亡率分別由2.53%、3.27%、4.83%、8.93%、14.27%增加至4.6%、5.47%、10.17%、 16.97%、29.1%；與對照組相比，5-FU(2.5、5 mmol·L-1)明顯促進HepG2細胞凋亡，與Z-GS(30 μmol·L-1) 聯用后，進一步增加5-FU對HepG2細胞凋亡誘導作用，凋亡率分別由0.73%、0.93%、1.07%、1.90%、3.33%增加至2.6%、3.8%、5.17%、9.63%、29.5%(P<0.05,Fig 2)。

Fig 2 Z-GS significantly increased DDP or 5-FU-induced apoptosis of HepG2 cells

2.3 Z-GS下調HepG2細胞中PXR和P-gp表達與對照組相比，3、10、30 μmol·L-1Z-GS處理HepG2細胞24 h后明顯降低HepG2細胞中PXR和P-gp蛋白表達，分別下調了17.81%、28.31%、47.18%和14.24%、31.44%、35.67%(P<0.05,Fig 3)；與對照組相比，DDP(25、50、100 μmol·L-1)明顯下調PXR和P-gp蛋白表達，且具有濃度依賴性，分別下調了14.90%、34.99%、38.02%和21.06%、36.81%、49.09%，Z-GS(30 μmol·L-1) 聯用增強DDP對PXR和P-gp蛋白表達的下調作用，進一步下調了35.28%、28.87%、24.41%和19.13%、4.3%、19.18%(P<0.05,Fig 4)。與對照組相比，5-FU(1.25、2.5、5 mmol·L-1)明顯下調PXR蛋白表達，5-FU(2.5、5 mmol·L-1)明顯下調P-gp蛋白表達,且具有濃度依賴性，分別下調了37.34%、43.80%、64.97%和39.30%、53.62%;Z-GS(30 μmol·L-1)聯用增強5-FU對PXR和P-gp蛋白表達的下調作用，進一步下調了40.18%、31.47%、19.53%和46.30%、20.67%、14.68%(P<0.05,Fig 5)。

Fig 4 PXR and P-gp were down-regulated by DDP alone or combined with Z-GS for 24 h in HepG2 cells n=5)

Fig 5 PXR and P-gp were down-regulated by 5-FU alone or combined with Z-GS in HepG2 cells n=5)

2.4 Z-GS下調HepG2細胞中MDR1 mRNA轉錄水平與對照組相比，30 μmol·L-1Z-GS明顯下調HepG2細胞中MDR1 mRNA的轉錄水平，下調了30.22%；與對照組相比，50 μmol·L-1DDP明顯下調HepG2細胞中MDR1 mRNA的轉錄水平，下調了52.81%，與30 μmol·L-1Z-GS聯用后，MDR1 mRNA轉錄水平進一步下調了10.02%；與對照組相比，2.5 mmol·L-15-FU明顯下調HepG2細胞中MDR1 mRNA的轉錄水平，下調了16.91%，與30 μmol·L-1Z-GS聯用后MDR1 mRNA轉錄水平進一步下調了20.04%(P<0.05，Fig 6)。

Fig 6 Expression of MDR1 mRNA was suppressed by chemotherapeutic agents alone or combined with Z-GS in HepG2 cells n=3)

2.5 沒藥甾酮下調RFP誘導的HepG2細胞中PXR和P-gp表達,進一步增強KTZ對PXR和P-gp表達的抑制作用與對照組相比，30 μmol·L-1RFP明顯上調HepG2細胞中PXR、P-gp蛋白表達，分別增加36.86%、132.33%;與Z-GS(30 μmol·L-1)聯用后明顯下調了RFP誘導的PXR和P-gp蛋白表達，分別降低57.47%、53.04%；40 μmol·L-1KTZ明顯下調PXR、P-gp蛋白表達，分別減少51.77%、30.90%，與Z-GS(30 μmol·L-1)聯用后，進一步下調KTZ抑制的PXR、P-gp蛋白表達，分別減少33.70%、41.00%(P<0.05,Fig 7)。

Fig 7 PXR and P-gp were regulated by RFP or KTZ alone or combined with Z-GS in HepG2 cells n=5)

3 討論

目前，原發性肝癌居我國常見惡性腫瘤第4位，腫瘤致死病因第2位[2]。臨床資料表明，肝切除術后5年復發率為60%～70%；全身治療和經肝動脈介入治療中使用的化療藥物耐藥問題也亟需解決[14]。近幾十年來，大量臨床和實驗研究表明，中藥輔助治療腫瘤是一種安全、有效的途徑[8]。Z-GS是來源于中藥沒藥的主要活性成分，其可通過調控PI3K/AKT、 JAK/STAT和NF-κB等信號通路促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖[15]。本課題組前期研究發現，沒藥甾酮可通過抑制環氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)下調P-gp在人慢性髓源白血病細胞K562中表達，逆轉K562對伊馬替尼耐藥[16]；還可下調耐阿霉素乳腺癌細胞MCF-7中P-gp表達，增強阿霉素對耐藥細胞的增殖抑制作用[17]。

腫瘤多藥耐藥引起的化療失敗通常與腫瘤細胞中化療藥物濃度降低有關，而腫瘤細胞細胞膜上ABC家族轉運子如P-gp/ABCB1/MDR1過表達是導致腫瘤多藥耐藥的重要因素[17]。P-gp表達受PXR調控，PXR 由N端DNA結合域(DNA binding domain，DBD)和C端配體結合域(ligand binging domain，LBD)組成，DBD有兩個鋅指結構和核定位序列(A/G)G(T/G)TCA，與靶基因的啟動子區域結合。PXR被激活前，和它的輔阻遏物結合并存在于細胞質，和配體結合后，PXR構象發生變化并且從與輔阻遏物的結合中游離出來，通過DBD的鋅指與視黃醇X受體(retinoid X receptor，RXR)結合形成異二聚體，使異二聚體穿過核孔進入細胞核，這個過程中PXR還招募共激活物以和靶基因的啟動子結合。PXR結合位點被MDR1基因上游增強子識別，然后開始MDR1基因轉錄[9]。本研究使用PXR誘導劑RFP和抑制劑KTZ初步證實了這一機制。

本研究結果表明，30μmol·L-1Z-GS對肝癌細胞HepG2無細胞毒作用，與化療藥物5-FU、DDP聯用，增強5-FU、DDP對HepG2細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用；進一步研究表明，Z-GS下調PXR/MDR1 mRNA-P-gp通路活性，增強化療藥物抗肝癌作用。Z-GS有望改善DDP、5-FU臨床療效，具有與化療藥物聯合用于治療HCC的前景，本文將為體內及臨床研究提供理論基礎。但沒藥甾酮是否對其他肝癌細胞系也有相似作用需進一步研究；沒藥甾酮是如何調控肝癌細胞中PXR/P-gp通路活性，尚需深入研究；同時，沒藥甾酮是否通過其他調控機制下調肝癌細胞中MDR1基因轉錄和P-gp表達也需進一步探索。