老年喉癌組織miR-362-3p、miR-217表達變化及其與腫瘤惡性程度相關因子的關聯性

金輝 楊麗萍 劉莉 汪斌如 梁耕田

(武漢市第三醫院耳鼻喉科，湖北 武漢 430000)

喉癌(LC)是臨床常見頭頸部惡性腫瘤之一，約占頭頸部惡性腫瘤的20%〔1〕。據報道，LC已發展成僅次于肺癌的第二大呼吸系統高發癌，嚴重威脅人類生命健康〔2〕。有研究顯示，LC發病可能與反復性胃食管反流、人乳頭瘤病毒感染、遺傳變異等因素有關，但具體發病機制尚未完全明確〔3〕。因此，積極探究LC發生發展相關分子標志物、作用機制對早期確診、評估預后具有重要潛在臨床價值。微小RNA(miRNA)是內源性非編碼小RNA，通過調控下游靶基因可特異性發揮作用，臨床已證實，其參與多種腫瘤發生發展過程，且在機體內多種體液內穩定表達，有望成為多種疾病分子標志物〔4〕。miR-362-3p是LC細胞中的c-Myc靶基因(MYCT1)下游調控基因，病理學研究顯示，其在乳腺癌、腎細胞癌、胃癌細胞遷移、侵襲中發揮關鍵作用〔5〕。miR-217在LC組織中呈低表達狀態，但其具體作用缺乏研究。本研究探討老年LC組織miR-362-3p、miR-217表達及其與腫瘤惡性程度相關因子的關聯性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年9月至2019年9月在武漢市第三醫院手術切除的老年LC組織與癌旁正常喉組織標本作為LC組及癌旁正常喉組各114例，喉良性病變組織標本作為喉良性病變組(96例)。均經病理診斷確診；符合LC診斷標準〔6〕；入組前未經放化療，無手術禁忌；排除標準：繼發性LC；伴其他原發性惡性腫瘤疾病者；合并全身感染性疾病者。本研究經醫學倫理委員會審批通過。

1.2方法 (1)miR-362-3p、miR-217檢測：取LC組織，同時取距離LC組織2 cm癌旁正常組織標本、喉良性病變組織標本，即刻置入液氮保存待檢。以實時聚合酶鏈反應(PCR)技術測標本內miR-362-3p、miR-217表達，采取Trizol試劑提取細胞、組織內RNA，以miRNA反轉錄試劑盒反轉為cDNA，轉錄條件：60 min 37℃，5 min 85℃，以U6作為內參，實時PCR測miR-362-3p水平。miR-217操作步驟同miR-362-3p，詳細以試劑盒說明書為準；顯微鏡下隨機選視野5個，并分別計數細胞，5個視野平均數作為最終結果。(2)血清腫瘤惡性程度相關因子檢測：以非抗凝管取晨空腹靜脈血3 ml，離心10 min(半徑8 cm，轉速3 500 r/min)取血清，保存至液氮待檢。以酶聯免疫吸附試驗檢測鱗狀細胞癌相關抗原(SCCAg)、細胞角化素蛋白19片段(CYFRA21-1)、糖類抗原(CA)199、癌胚抗原(CEA)、胸苷激酶(TK)1水平。試劑及試劑盒為上海西塘生物科技有限公司提供，并由相同資深專科醫師規范操作完成。

1.3統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行χ2檢驗、Logistic回歸分析、t檢驗、Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1各組miR-362-3p、miR-217表達 LC組中miR-362-3p表達顯著高于喉良性病變組及癌旁正常喉組，miR-217表達顯著低于喉良性病變組及癌旁正常喉組(均P<0.05)，見表1。

2.2miR-362-3p、miR-217表達和LC組一般資料、臨床病理參數的關系 miR-362-3p、miR-217表達與LC患者年齡、性別、組織分化程度之間無顯著相關性(P>0.05)；臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移LC患者miR-362-3p表達顯著高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者，而miR-217表達顯著低于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者(均P<0.05)，見表2。

表1 各組織標本中miR-362-3p、miR-217表達對比

表2 LC組miR-362-3p、miR-217表達和一般資料、臨床病理參數的關系

2.3LC發病有關影響因素的多元回歸分析結果 以是否發生LC為因變量，將患者年齡、性別與組織miR-362-3p、miR-217為自變量實施Logistic回歸分析，結果發現，組織miR-362-3p、miR-217均為LC發病的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 LC發病有關影響因素的多元回歸分析結果

2.4LC組與喉良性病變組血清腫瘤惡性程度有關因子表達 LC組血清SCCAg、CYFRA21-1、CA199、CEA、TK1表達顯著高于喉良性病變組(P<0.05)，見表4。

表4 LC與喉良性病變患者血清腫瘤惡性程度有關因子表達比較

2.5miR-362-3p、miR-217表達與LC組血清腫瘤惡性程度有關因子關聯性 miR-362-3p表達與LC組血清SCCAg、CYFRA21-1、CA199、CEA、TK1水平呈正相關，miR-217表達與上述指標均呈負相關(P<0.01)。見表5。

表5 miR-362-3p、miR-217表達與LC組血清腫瘤惡性程度有關因子關聯性(n=114，r/P值)

3 討 論

近年LC患病率有升高趨勢，盡管手術、放射及基因治療技術不斷進步，但喉功能保留率差，尤其是老年患者，5年生存率較低，早期發現癌變可疑跡象，并合理干預是改善預后的關鍵〔7，8〕。LC發生發展與眾多腫瘤一樣，是涉及多因素、多基因參與的一個復雜過程。

miR-217是一種重要miRNA，參與腫瘤發生、發展過程〔9〕。謝琳等〔10〕研究顯示，miR-217能通過靶向絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路阻滯人腦膠質瘤細胞增殖、侵襲。徐健等〔11〕證實，miR-217與長非編碼沉默RNA MALAT1結合能抑制食管鱗狀癌細胞增殖、遷移、侵襲。徐菲等〔12〕指出，miR-217可誘導胰島素樣生長因子1類受體(IGF1R)基因表達誘導卵巢上皮癌細胞凋亡，并抑制其惡性生物學行為，與卵巢癌病理分期、分級關系密切。但miR-217在LC發病發展中的具體機制，臨床尚缺乏大量數據支持。本研究說明miR-217在LC發生、發展中扮演抑癌基因角色，可抑制LC惡性生物學行為。

miR-362也是miRNA家族主要組成部分，但臨床報道，miR-362具有組織特異性，在不同腫瘤組織內作用不同，腎癌及乳腺癌內發揮抑癌基因效果，胃癌、肝癌內發揮癌基因作用〔13，14〕。本研究結果與劉揚帆等〔15〕、Miao等〔16〕研究結果近似。此外，本研究結果提示miR-362-3p在LC中發揮潛在癌基因作用。臨床證實，miRNA通過降解或抑制靶基因mRNA生物活性發揮生物學功能〔17〕。miR-362-3p靶向作用于CD82刺激胃癌組織細胞向皮間質轉化〔18〕；腎細胞癌中miR-362-3p表達降低，并靶向Nemo樣激酶抗體抑制惡性細胞侵襲活性，在其他類型疾病中miR-362-3p能通過抑制含Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS)-1活性阻斷血管平滑肌細胞遷移，且可靶向Pax3阻滯滋養層細胞增殖、遷移、侵襲〔19〕。但miR-362-3p具體通過哪種靶基因刺激LC細胞遷移、侵襲，本研究未進行探究，需后續研究進一步證實。

SCCAg、CYFRA21-1、CA199、CEA、TK1均是臨床常用腫瘤惡性程度評估血清學指標，且多種腫瘤標志物聯合檢測敏感性、特異性理想。本研究結果與沈敏等〔20〕研究結果一致。提示LC組織miR-362-3p、miR-217表達與惡性程度關系密切，臨床檢測其表達狀態可有效評估病變情況。

綜上，老年患者LC組織中miR-362-3p、miR-217表達異常，且與惡性程度關系密切，其異常表達是LC發病發展獨立危險因素，臨床檢測LC組織中miR-362-3p、miR-217表達對診斷及評估惡性程度具有重要意義。