帕金森病患者血漿α-synuclein、LC3、CacyBP/SIP水平與臨床癥狀的相關性

明敬峰 魏紅玉 張永進 劉平國 李曉靜 吳毅杰 李瑞霞 蔡增林

(1南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院神經內科，江蘇 南京 215000；2連云港市第一人民醫院神經內科)

α-突觸核蛋白(α-synuclein)是一種在神經元中表達豐富由SNCA基因編碼的由140個氨基酸構成小分子蛋白質。α-synuclein的降解障礙是帕金森病(PD)的主要病理特征，在遺傳因素、環境因素、年齡老化、氧化應激等多種因素相互作用下，α-synuclein發生錯誤的折疊并在細胞內聚集不能及時降解進而導致多巴胺能神經元死亡〔1〕。正常生理狀況下，神經元通過質量控制系統對α-synuclein的生成與降解整個過程進行監控，一旦其結構出現異常神神經元就會對其進行修復或將其清除。自噬-溶酶體途徑(ALP)是神經元修復和清除異常蛋白的最主要途徑之一〔2〕。神經元ALP一旦異常，就會引起細胞內有害蛋白的積累，造成神經元的損害，最終引起神經退行性疾病。微管相關蛋白1輕鏈(LC)3，是哺乳動物自噬相關基因(ATG)8蛋白的同源物，是第一個被發現定位于自噬體膜上的自噬體標記蛋白，是自噬體的重要組成部分，其含量的多少與自噬體數量正相關〔14〕，目前在人體內發現LC3 有三種亞型，分為 LC3a、LC3b、LC3c，可以通過它們表達水平推斷細胞自噬水平〔3〕。鈣周期素結合蛋白(CacyBP/SIP)是一個廣泛參與蛋白質的去磷酸化，細胞骨架穩態，基因調控，細胞增殖，分化和致癌等代謝過程的小分子蛋白質〔4〕。CacyBP/SIP可能對于維持微管穩態從而在自噬體形成及自噬體、溶酶體融合過程中起重要作用和通過調節降解自噬正性調節因子 P27 參與自噬的調節〔5〕。總之，目前關于PD的發病機制目前不是很清楚，也沒有根治的藥物，找到一種能早期診斷PD的生物學標志物及尋找一個針對PD藥物治療的新方向對PD診斷與治療具有重要臨床意義。本文旨在探討PD患者外周血漿α-synuclein、LC3、CacyBP/SIP與PD臨床癥狀的相關性。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取 2016年7月至2017年11月在連云港第一人民醫院神經內科及門診就診并確診為PD的患者47例為PD組，納入標準：①年齡55～80歲住院病人；②受試者已了解并簽署知情同意書，同意留取血標本及配合相關評估；③PD患者符合2015年由國際運動障礙協會(MDS)制定的帕金森病診斷標準。排除標準：①合并惡性腫瘤、肝炎、腎臟疾病或其他嚴重疾病者；②繼發性帕金森綜合征、腦炎、有重大腦血管疾病、顱腦外傷手術病史者；③存在嚴重代謝性疾病、藥物中毒或重度抑郁等原因導致認知功能障礙者；④有PD家族遺傳病史。本研究經南京醫科大學倫理委員會審查批準。同一時間段內隨機選取與患者組性別、年齡相匹配的健康體檢者 25例作為對照組。其中PD組男28例、女19例，平均年齡(68.96±6.90)歲，對照組男14例、女11例，平均年齡(66.40±4.24)歲；兩組年齡及性別無顯著差異(P>0.05)。同時由同一位神經內科醫師對PD患者組按臨床癥狀進行Hoehn-Yahr分期(測評時，PD 患者都沒有使用抗PD藥物)，總共招募到Ⅱ期患者21例，Ⅲ期21例，Ⅳ期5例。

1.2血漿中α-synuclein、LC3、CacyBP/SIP水平檢測 ①血漿樣本采集。分別抽取PD患者和對照組正常人空腹外周靜脈血2 ml，用檸檬酸鈉抗凝，再以高速離心機以3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿，下層血清，將上層血漿置于-80℃冰箱冰凍待檢，全部血漿樣本同一批次相同條件下檢測記錄實驗數據。②血漿α-synuclein蛋白水平檢測。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法按人Alpha-synucleinELISA試劑盒(ABCam公司，編號：ab210973)內說明書檢測血漿α-synuclein蛋白水平：按試劑盒試劑說明書配制洗脫液、抗體混合物、標準品及樣品稀釋。標準品按要求配制一系列濃度，分別為0，282，421，632，948，1 422，2 133，3 200 pg/L。在酶標板上設置兩列標準品孔，一列實驗孔一列復孔，每列包括8個孔；按照試劑說明書向每孔中依次加入50 μl的標準品溶液和樣品溶液。分別向每個孔中加入50 μl抗體混合物，輕輕溫和混勻；用封口膠帶密封酶標板，室溫條件下在300 r/min搖床上孵育1 h后，輕輕甩去孔內液體，向每孔加入350 μl洗滌液，每次浸潤1 min左右，共3次，最后一次洗完后，輕輕甩去孔內液體，將酶標板倒置，用吸水紙吸去殘留的液體；分別向每孔中加入100 μl底物溶液，室溫條件下在300 r/min搖床上孵育10 min(避光)；待到時間后，立即向每孔中加入100 μl終止液，終止顏色發展反應；加完終止液后立即用酶標儀在450 nm波長下測定各個孔的OD值，根據標準品濃度運用EXCEL2010繪制標準曲線，要求R>0.99，再根據公式計算出各樣本濃度。③血漿LC3A蛋白水平檢測。按人LC3A ELISA試劑盒試劑(RnD公司，編號：DY8558-05)說明書配制洗滌液、檢測抗體、HRP綴合物、底物溶液及標準品溶液。標準品溶液按要求配制一系列濃度，分別為0.0，15.6，31.3，62.5，125.0，250.0，500.0，1 000.0 pg/L。在酶標板上設置兩列標準品孔，一列實驗孔一列復孔，每列包括8個孔；按照試劑說明書向每孔中依次加入100 μl的標準品溶液和樣品溶液，用封口膠帶密封酶標板，在室溫條件下孵育2 h。分別向每個孔中加入100 μl檢測抗體，輕輕混勻。用封口膠帶密封酶標板，在室溫條件下孵育2 h后，按照酶標板制備步驟3洗滌每孔；分別向每個孔中加入100 HRP綴合物溶液，在室溫條件小孵育20 min；時間到后，立即向每孔中加入50 μl終止液，立即用酶標在450 nm波長下測定各個孔的OD值，根據標準品濃度運用EXCEL2010繪制標準曲線，要求R>0.99，再根據公式計算出各樣本濃度。④血漿CacyBP蛋白水平檢測。按人CacyBPELISA試劑盒試劑(Lifespa公司，編號：ls-f23970)說明書配制洗滌液、檢測抗體、HRP綴合物及標準品。標準品按要求配制一系列濃度，分別為0.00，78.15，156.30，312.50，625.00，1 250.00，2 500.00，5 000.00 pg/L。在酶標板上設置兩列標準品孔，一列實驗孔一列復孔，每列包括8個孔；按照試劑說明書向每孔中依次加入50 μl的標準品溶液和樣品溶液，標準品溶液從低到高濃度依次加入，待測樣品按照樣本的編號順序依次加入；分別向每個孔中加入100 μl抗體混合物，輕輕混勻。用封口膠帶密封酶標板，37℃水浴溫箱孵育90 min，輕輕甩去孔內液體；分別向每個孔中加入100 μl檢測抗體，用封口膠帶密封酶標板，37℃水浴溫箱內孵育60 min；分別向每孔中加入100 μl HRP綴合物，用封口膠帶密封酶標板，37℃水浴溫箱內孵育30 min；分別向每孔中加入90 μl底物溶液，用封口膠帶密封酶標板，37℃水浴溫箱內孵育15 min后，立即向每孔中加入50 μl終止液，立即用酶標在450 nm波長下測定各個孔的OD值，根據標準品濃度運用EXCEL2010繪制標準曲線，要求R>0.99，再根據公式計算出各樣本濃度。

1.3統計學分析 應用SPSS22.0軟件進行t、χ2檢驗、方差分析、非參數檢驗、Spearman相關性分析。

2 結 果

2.1兩組血漿中α-synuclein蛋白水平比較 PD組外周血漿中α-synuclein蛋白〔(3 138.27±175.00)pg/ml〕明顯高于對照組〔(2 899.48±409.34)pg/ml，t=3.459，P<0.05〕。

2.2兩組血漿LC3a蛋白水平比較 PD組外周血漿LC3a蛋白〔(87.14±27.72)pg/ml〕明顯低于對照組〔(114.87±46.77)pg/ml；t=-3.162，P=0.002〕。

2.3PD患者不同Hoehn-Yahr分級血漿LC3a蛋白水平比較 不同Hoehn-Yahr分期的PD患者血漿中LC3a蛋白水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，PDⅡ期患者血漿中LC3a蛋白水平〔(99.02±27.89)pg/ml〕明顯高于PDⅢ期患者〔(82.47±23.65)pg/ml，P<0.05〕；PDⅢ期患者血漿中LC3a蛋白的水平明顯高于PDⅣ期患者〔(56.88±12.22)pg/ml，P<0.05〕。

2.4PD患者血漿中LC3a蛋白水平與不同Hoehn-Yahr分期相關性 PD患者血清中LC3a蛋白水平與Hoehn-Yahr分期呈負相關(r=-0.457，P=0.001)。

2.5兩組血漿CacyBP/SIP蛋白水平比較 PD組外周血漿CacyBP/SIP蛋白〔(139.74±34.57)pg/ml〕與對照組〔(144.47±38.44)pg/ml〕差別無統計學意義(t=0.532，P=0.596)。

2.6PD患者不同Hoehn-Yahr分級血漿中CacyBP/ SIP蛋白水平比較 不同Hoehn-Yahr分期的PD患者血漿中CacyBP/SIP蛋白水平比較，均無明顯差異(P>0.05)。PDⅡ期患者血漿中CacyBP/SIP蛋白的水平〔n=21，(140.86±31.53)pg/ml〕與PDⅢ期患者〔n=21，(136.73±38.29)pg/ml〕比較，差異無統計學意義(P>0.05)；PDⅢ期患者血漿中CacyBP/SIP蛋白的水平與PDⅣ期患者〔n=5，(147.67±36.13)pg/ml〕比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

PD最早的病理特征主要集中在殘存神經元內形成的嗜酸性路易小體(LB，其主要成分是α-synuclein)和黑色素的功能上〔6〕。α-synuclein是一種在神經元中表達十分豐富的蛋白質，主要由大腦黑質、海馬及紋狀體神經元表達。α-synuclein蛋白異常聚集是PD發生的重要因素之一，α-synuclein異常聚集會產生神經細胞毒性，引起特定腦區的細胞脫失，從而引起包括PD 在內的多種突觸核蛋白疾病〔7〕。正常生理情況下，大腦神經元內的α-synuclein沒有特定空間結構，當外界環境改變時，α-synuclein的空間結構就會隨之發生改變，形成富含β-折疊的不可溶形式在神經元內集聚成寡聚體，進而形成路易小體損失神經元，最終造成多巴胺能神經元的死亡〔8〕。

近年來，國內外學者已經做了很多對于血漿中α-synuclein蛋白濃度與PD的相關性的研究，但是他們研究的結果并不一致。Lee等〔9〕在實驗中，應用ELISA對105例PD患者及51例正常對照者血漿中α-synuclein蛋白含量進行檢測，結果發現PD患者血漿α-synuclein蛋白含量明顯比正常人高。Duran等〔10〕通過ELISA檢測53例未治療過PD患者、42例治療過PD患者及60例正常對照者血漿中α-synuclein蛋白水平時，結果發現治療組及未治療組α-synuclein蛋白的水平比正常人高，治療組及未治療組α-synuclein蛋白的表達水平無明顯變化。

對于當前不同的學者所測血漿α-synuclein蛋白濃度存在較大差異，考慮與民族遺傳背景及環境不同有關，本研究為避免此情況出現，實驗對象均為漢族，長期在本地區居住。本研究結果和Lee等〔9〕研究結果相同，顯示出血漿中α-synuclein蛋白可能作為PD生物標志物，從而幫助臨床醫師對PD的診斷。同時也說明α-synuclein蛋白異常聚集是PD發生的重要因素之一，在發病前減少聚集的α-synuclein蛋白，減輕對神經元的損失，可有效地預防PD的發生。大量異常的α-synuclein蛋白在多巴胺神經元內積聚對其造成損害從而引起死亡被認為是造成PD發生的重要原因〔11〕。因此，未來我們可以通過研究藥物抑制α-synuclein蛋白的異常聚集，從而阻止PD的發生，降低PD的發病率。總之，本研究結果為α-synuclein蛋白用于PD的診斷和開發針對其降解藥物預防PD的發生提供了一個臨床依據。

LC3是人類在真核細胞中發現的第1種自噬體膜蛋白，它是自噬體的重要組成部分，其含量的多少與自噬體的數量呈正相關〔12〕。Schmid等〔12〕通過人為干擾SIAH1基因后，結果發現LC3II的蛋白表達水平明顯降低，LC3的mRNA水平減低，細胞自噬活性降低。在人體內目前發現LC3 有三種亞型，LC3a是其中之一，可以通過檢測其表達水平可以推斷出細胞的自噬水平。

本研究結果顯示血漿中LC3a蛋白可能作為PD生物標志物，從而幫助臨床醫師對PD的診斷。同時也說明PD患者自噬水平較正常人下降，自噬參與PD的發生。血漿中LC3a蛋白參與PD病程的進展，可用于監測其病情的進展。本研究推測，PD患者的自噬水平下降，從而導致異常α-synuclein蛋白清除障礙，使其在神經元內積聚損失神經元造成死亡，最終導致PD的發生。由此來看，自噬在PD的發病機制中起著重要作用。通過藥物增強PD神經元的自噬功能，清除神經元內有害物質，可以挽救瀕臨死亡的神經元，從而延緩PD病人病情的進展，改善其生活質量。

CacyBP/SIP是一種參與多領域和有多種功能的蛋白質，廣泛參與細胞新陳代謝過程中，對細胞的細胞骨架重排、去磷酸化、泛素化、基因轉錄調控及細胞增殖分化等生化過程中起重要作用。CacyBP/SIP最初被確定為S100A6(calcyclin)靶標，后來被認定為Siah-1相互作用蛋白〔13〕。CacyBP/SIP在哺乳動物不同組織類表達，在神經系統內高表達〔14〕。Filipek等〔15〕在研究CacyBP/SIP在培養的神經元和年輕和老齡大鼠的腦神經元中的定位實驗中，發現在幼年大鼠的神經元中CacyBP/SIP蛋白主要在神經元內胞體和突觸內表達中，在老齡大鼠神經元中CacyBP/SIP則主要在神經元胞體表達。

目前對于CacyBP/SIP在神經變性退行性疾病研究較少。阿爾茨海默病(AD)患者腦組織中的Tau蛋白常存在過度磷酸化，是正常功能喪失的重要原因之一。Tau蛋白在微管蛋白系統的含量是最高的，而微管蛋白系統是神經元骨架的重要組成成分，對于維持細胞正常生理功能具有重要作用，CacyBP/SIP可以使tau蛋白磷酸化參與AD病理過程中。Wasik等〔16〕在研究AD患者的腦組織和具有AD的特征性AD模型的轉基因小鼠實驗中，發現在AD患者和AD模型轉基因小鼠的大腦中，CacyBP/SIP幾乎全部存在于神經元胞體中，并檢測到AD患者腦組織中的Tau蛋白常存在過度磷酸化，說明CacyBP/SIP可能在AD病理中起重要作用。

本研究說明血漿中CacyBP/SIP不能用于PD的診斷。對于PD組患者于對照組血漿中CacyBP/SIP水平無差異，考慮其分子量大，不易通過血腦屏障進入血漿，關于其在PD中的可能作用，尚待更進一步的研究來證明。