脂聯(lián)素對子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞株增殖和凋亡的影響

春蓮 吳福林 吳偉樂斯 其勒木格 吳薩仁圖雅 昂和利瑪

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院 1婦科，內(nèi)蒙 通遼 028000；2胸外科；3內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院；4內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床(蒙)醫(yī)學(xué)院)

子宮內(nèi)膜癌是臨床上女性生殖道常見的三大惡性腫瘤之一，約占30%〔1,2〕。近年來由于子宮內(nèi)膜癌發(fā)病逐漸年輕化且發(fā)病率和死亡率逐年升高，已成為嚴(yán)重威脅女性生命健康和生存質(zhì)量的危險因素〔3,4〕。子宮內(nèi)膜癌常見的臨床治療方法是手術(shù)和激素療法，但因子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)致使患者的治療效果較差，因此尋找更佳治療方案勢在必行〔5,6〕。研究報道脂聯(lián)素(APN)對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有一定的抑制作用〔7〕，本實(shí)驗(yàn)研究以子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞株為研究對象，從細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及其調(diào)控通路方面，探究APN對子宮內(nèi)膜癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器 子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞株購于南京科佰生物技術(shù)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液、96孔培養(yǎng)板、6空培養(yǎng)板、25 ml培養(yǎng)瓶和胎牛血清購于Gibco公司；抗菌素、胰酶購于北京鼎國生物有限公司；APN購于美國Sigma公司；抗人的B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、生存素(survivin)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)及蛋白激酶B(Akt)酶聯(lián)免疫試劑盒購于南京建成生物有限公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購于北京百奧生物技術(shù)有限公司；Trizol和實(shí)時熒光定量試劑盒購于Thermo公司；引物由Invitrogen公司提供合成。酶標(biāo)儀購于美國BIOTIC公司；實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購于美國MJ Research公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與給藥 將購買的人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞株使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置于25 ml培養(yǎng)瓶37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待傳至第三代時分組接種于96和6孔培養(yǎng)板(每組設(shè)5個復(fù)孔)，實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對照組、低劑量APN組(5 μg/ml)、中劑量APN組(10 μg/ml)、高劑量APN組(20 μg/ml)；2 h細(xì)胞貼壁后給藥APN 5、10、20 μg/ml。

1.3方法

1.3.1CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖 人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞株(96孔培養(yǎng)板)給藥APN 5、10、20 μg/ml 48 h后(每組設(shè)5個復(fù)孔)，采用CCK-8試劑盒，每孔加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀(450 nm)檢測。細(xì)胞增殖抑制率=(空白組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白組OD值×100%。

1.3.2Annexin V-FITC試劑盒檢測細(xì)胞凋亡 參照1.3.1(6孔培養(yǎng)板)，消化收集每孔1×105細(xì)胞棄掉上清液，采用Annexin V-FITC試劑盒，每個收集管加入200 μl Annexin V-FITC重新混勻懸浮細(xì)胞，然后加入10 μl碘化丙啶(PI)液避光室溫染色20 min，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.3凋亡相關(guān)蛋白含量檢測 凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、survivin及相關(guān)調(diào)控通路PI3K、PTEN、Akt的蛋白含量均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測，設(shè)定空白、標(biāo)準(zhǔn)、待測孔，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，操作嚴(yán)格遵循試劑盒步驟。

1.3.4凋亡相關(guān)因子和調(diào)控通路相關(guān)因子mRNA水平的檢測 凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、Caspase-3、survivin及相關(guān)調(diào)控通路PI3K、PTEN、Akt的mRNA水平均采用實(shí)時熒光定量PCR檢測，經(jīng)過Trizol提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、實(shí)時熒光定量擴(kuò)增PCR，用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA目的基因相對表達(dá)水平，取Ct均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同劑量APN對子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞株細(xì)胞增殖影響的比較 與空白對照組比較，低、中、高劑量APN組的細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

2.2不同劑量APN對子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞株細(xì)胞凋亡影響的比較 與空白對照組比較，低、中、高劑量APN組細(xì)胞凋亡率均顯著升高且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表1。

表1 不同劑量APN對KLE細(xì)胞株細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率影響的比較

2.3各組凋亡蛋白含量比較 與空白對照組比較，低、中、高劑量APN組Bcl-2、survivin、PI3K、Akt蛋白含量均顯著降低，Bax、Caspase-3、PTEN蛋白含量均顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

表2 各組凋亡蛋白水平比較

2.4不同劑量APN對子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞株凋亡相關(guān)因子和調(diào)控相關(guān)通路因子的mRNA水平的影響 與空白對照組比較，低、中、高劑量APN組Bcl-2、survivin、PI3K、Akt mRNA水平均顯著降低，Bax、Caspase-3、PTEN mRNA水平均顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表3。

表3 不同劑量APN對KLE細(xì)胞株細(xì)胞凋亡和調(diào)控相關(guān)通路因子mRNA水平的影響

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌患者發(fā)病多為早期發(fā)現(xiàn)，治療比較及時且有效，預(yù)后較好，但發(fā)展中國家因?yàn)樯钏胶歪t(yī)療水平的局限性，其患者常發(fā)現(xiàn)較晚，因此死亡率要高于發(fā)達(dá)國家，給患者本人及親屬帶來沉重的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔8～11〕。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生較為多見的原因是環(huán)境和基因因素，其發(fā)展多與細(xì)胞過度增殖分化、細(xì)胞凋亡減少及信號傳導(dǎo)通路缺陷相關(guān)〔12,13〕。APN是脂肪細(xì)胞分泌的一種多肽型的激素蛋白，它與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，特別是對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有抑制作用〔14,15〕；CCK-8實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測細(xì)胞增殖分化情況；Annexin V-FITC實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測細(xì)胞凋亡率情況；Bcl-2、survivin是抑制凋亡基因，Bax、Caspase-3是促凋亡基因；PI3K/Akt信號通路中PI3K是原癌基因、PTEN是抑癌基因，Akt是二者下游的靶向效應(yīng)分子〔1,16～19〕。本研究結(jié)果說明APN能抑制子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞株的細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；通過抑凋亡基因和促凋亡基因的檢測，明確APN能上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)、下調(diào)抑凋亡基因的表達(dá)；通過刺激PTEN活化，能使PI3K去磷酸化抑制Akt活化，起到抑制腫瘤生長的作用。

綜上，APN抗腫瘤的治療效果，可能與抑制子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞株的細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、上調(diào)促凋亡基因、下調(diào)抑凋亡基因及激活PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)，且隨劑量增加效果更為明顯。