七葉蓮花醇提物減輕丁哌卡因大鼠中樞神經毒性反應及心臟毒性的機制

祝勁松 陳榮 韓徐 唐松江

(貴陽中醫藥大學第一附屬醫院麻醉科，貴州 貴陽 550002)

局部麻醉(局麻)是臨床上通常采用的麻醉方法，其特點是術后恢復平穩、保持清醒及經濟實惠等，但近年來，局麻藥的中樞神經毒性反應和心臟毒性受到越來越多的關注〔1〕。丁哌卡因作為一種長效的局麻藥，若其使用過量或誤入血管可產生嚴重的中樞神經毒性反應和心臟毒性，嚴重威脅患者的生命健康〔2～4〕。臨床麻醉中預先給予咪達唑侖、丙泊酚等麻醉藥預防及治療丁哌卡因引起的心臟毒性及中樞神經毒性反應，取得了一定的效果，但同時也出現了呼吸抑制、循環抑制等并發癥〔5〕。研究發現多種中藥對丁哌卡因造成的中樞毒性反應及心臟毒性有一定的預防作用〔6〕。《中華本草苗藥卷》記載七葉蓮有抗驚厥、增強心肌收縮力、行氣止痛、活血消腫、壯筋骨等多種作用〔7～10〕。研究表明七葉蓮含有萜烯類、有機酸、皂苷類等化合物，對中樞神經系統有鎮靜、鎮痛及抗驚厥作用，除此之外，腹腔注射七葉蓮注射液能夠增加心肌收縮力〔11〕。同時，七葉蓮花作為七葉蓮新的藥用部位，研究表明其醇提物具有抗炎、鎮痛活性〔9，12，13〕。但是，七葉蓮花醇提物對局麻藥丁哌卡因誘發中樞神經毒性反應和心臟毒性的作用研究較少，本研究探討七葉蓮花醇提物對丁哌卡因引起中樞神經毒性反應及心臟毒性的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與藥物 取七葉蓮花以60%乙醇溶液滲漉提取，減壓濃縮成浸膏，由南京歐際醫藥科技服務有限公司提取制備，實驗時給大鼠灌胃給藥。鹽酸丁哌卡因(阿拉丁公司)，用微量注射泵經股靜脈泵注給藥。75只健康雄性成年SD大鼠(貴陽中醫學院實驗動物研究所提供)。體重200～350 g，隨機分為5組，對照組(D組)、3種不同劑量七葉蓮花醇提物組(S1組、S2組、S3組)及陽性藥組(P組)。每組15只。

1.2實驗試劑與儀器 一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)測定試劑盒、蛋白裂解液、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、總RNA裂解液Trizol(碧云天)；anti-NMDA1 antibody、anti-NMDA2B antibody、β-actin抗體(CST)；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IG、HRP標記山羊抗鼠IG(Abcam)。生理參數記錄使用儀(COLINBP-508，日本考林公司)；NanoDrop 2000 Spectrophotometer、熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)儀(ABI Stepone plus型)、酶標儀(賽默飛)；Bio-Rad GelDoc EZ凝膠成像系統(Bio-Rad)。

1.3實驗方法 所有動物實驗經過動物倫理委員會的同意和批準，給藥劑量參考之前的文獻〔13〕S1組(七葉蓮3.06 g/kg)、S2組(七葉蓮6.12 g/kg)、S3(七葉蓮12.24 g/kg)，P組(丙泊酚100 mg/kg)。造模前灌胃給予七葉蓮花醇提物，1次/d，連續3 d，D組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。

1.4動物模型制作 實驗前，大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，并維持大鼠持續純氧吸氧狀態，固定于操作實驗臺，將三根針式電極針分別插入大鼠雙上肢及右下肢皮下，監測12導聯心電圖(ECG)。暴露股動脈，放入24G套管針用于監測平均動脈壓(MAP)和抽取血樣，進行血氣分析。按2 mg/(kg·min)速度經股靜脈勻速持續泵注丁哌卡因，同時監測大鼠MAP、心率和ECG，觀察記錄大鼠出現抽搐、心律失常(以QRS波延長為標準)、循環塌陷(以MAP降至40 mmHg為標準)和心搏驟停時間。在泵藥前、出現抽搐及循環塌陷時抽取血樣，進行血清生化檢測，分別計算大鼠出現抽搐、心律失常、循環塌陷和心搏驟停時丁哌卡因的累積劑量。

1.5海馬神經元凋亡TUNEL染色檢測 大鼠海馬組織冰凍切片，4%多聚甲醛固定30 min，用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中的0.1%Triton X-100透化10 min，置于TUNEL反應物中避光37℃孵育60 min，PBS洗滌3次，隨后使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染細胞核15min，封片，用免疫熒光顯微鏡觀察并拍照，使用ImageJ軟件進行圖像處理和量化。海馬組織N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)1、NMDA2B mRNA檢測采用Primer Express 2.0軟件設計引物，NMDA1：正義鏈：5′-GATAGAAAGAGTGGTAGAGC-3′，反義鏈：5′-CCAGGGTGGAGGTGATAGCC-3′；NMDA2B：正義鏈：5′-ACCAATAAGCCAGTGGTGGTC-3′，反義鏈：5′-CACAGGGGTTGGACTGGTTC-3′；β-actin：正義鏈：5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′，反義鏈：5′-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。分離和收集實驗大鼠海馬組織，稱取約30 mg，加入1 ml Trizol，組織研磨儀勻漿，提取組織總RNA，用NanoDrop 2000 Spectrophotometer檢測RNA的濃度和純度，用逆轉錄試劑盒和DNA清除試劑將RNA(1 μg)逆轉錄為cDNA，使用配有熒光定量PCR試劑的熒光定量PCR系統進行qRT-PCR定量分析，擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性15 s，60℃延伸30 s，重復40個循環，最后根據2-ΔΔCt法計算NMDA1、NMDA2B相對于甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA的表達水平。

1.6海馬組織NMDA1、NMDA2B蛋白檢測 分離收集實驗大鼠海馬組織，稱取約30 mg，加入0.5 ml蛋白裂解液，研磨儀組織勻漿，Western印跡檢測海馬組織NMDA1和NMDA2A蛋白表達。根據制造商說明操作提取組織總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量，加入結合緩沖液于100 ℃煮沸5 min，然后采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電泳條件：80 V，30 min；120 V，60 min。隨后采用100 V，90 min將電泳分離后的蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉60 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用一抗(NMDA1、NMDA2B及GAPDH，按1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5 min/次，用二抗(HRP標記山羊抗兔IG和HRP標記山羊抗鼠IG，按1∶10 000稀釋)室溫孵育90 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用電化學發光(ECL)法顯影檢測，ImageJ分析灰度值。

1.7統計學方法 采用GraphPad Prism8.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1七葉蓮花醇提物對丁哌卡因大鼠中樞神經毒性反應和心臟毒性的影響 泵注丁哌卡因后，與D組相比，S2組、S3組、P組出現抽搐、心律失常、循環衰竭、心搏驟停時，泵注丁哌卡因的累積劑量顯著升高；S1組出現心律失常、循環衰竭時，泵注丁哌卡因的累積劑量顯著升高(均P<0.05)，見表1。

表1 大鼠泵注0.5%丁哌卡因出現中樞神經毒性反應和心臟毒性的用量比較

2.2七葉蓮花醇提物對丁哌卡因大鼠MAP的影響 泵注丁哌卡因之前，5組MAP水平均無顯著差異(P>0.05)；與泵注前相比，出現抽搐和心律失常時，5組MAP水平均顯著升高(均P<0.05)，且出現抽搐時，S1組、S2組、S3組及P組MAP水平均顯著低于D組；發生心律失常時，僅S3組和P組MAP水平均顯著低于D組(P<0.05)。見表2。

2.3七葉蓮花醇提物對丁哌卡因大鼠NO和NOS水平的影響 在泵注丁哌卡因之前，5組NO和NOS水平差異均無統計學意義(P>0.05)，出現抽搐時5組NO水平均顯著高于泵注前(P<0.05)，循環衰竭時恢復至泵注前水平，且出現抽摔時，S1組、S2組、S3組、P組NO水平顯著高于D組(P<0.05)；在抽搐和循環衰竭時，S1組、S2組、S3組、P組NOS水平均顯著高于D組(P<0.05)，見表3。

表2 大鼠泵注0.5%丁哌卡因不同時間點MAP水平比較

表3 大鼠泵注0.5%丁哌卡因不同時間點NO含量和NOS水平變化

2.4七葉蓮花醇提物對丁哌卡因大鼠海馬NMDA受體mRNA表達的影響 與D組相比，S2組、S3組、P組NMDA1和NMDA2B mRNA表達水平顯著下調(均P<0.05)，見表4。

2.5七葉蓮花醇提物對丁哌卡因大鼠海馬神經元凋亡的影響 D組海馬神經元出現了與凋亡相關的形態變化，如核濃縮、核收縮及凋亡小體形成等，見圖1。D組海馬神經元凋亡率〔(69.05±2.90)%〕顯著高于S1組、S2組、S3組、P組〔(44.48±2.66)%、(40.04±5.08)%、(22.93±2.29)%、(32.12±4.42)%，均P<0.05〕。

表4 大鼠泵注0.5%丁哌卡因海馬NMDA受體mRNA水平比較

2.6七葉蓮花醇提物對丁哌卡因大鼠海馬NMDA受體蛋白表達的影響 與D組相比，S2組、S3組、P組海馬組織中NMDA1和NMDA2B蛋白表達水平顯著下調(均P<0.05)，見圖2、表5。

圖1 七葉蓮花醇提物對丁哌卡因大鼠海馬神經元(TUNEL染色，×40)

圖2 七葉蓮花醇提物對丁哌卡因大鼠海馬中NMDA受體蛋白表達的影響

表5 大鼠泵注0.5%丁哌卡因海馬NMDA受體蛋白表達變化

3 討 論

本研究表明在泵注丁哌卡因之前，灌胃給予SD大鼠七葉蓮花醇提物能夠顯著增加丁哌卡因大鼠出現抽搐、心律失常、循環衰竭及心搏驟停的丁哌卡因累積劑量，提高中毒耐受劑量；七葉蓮醇提物能夠顯著降低丁哌卡因引起的海馬神經元凋亡；能夠減輕丁哌卡因引起的中樞神經毒性反應和心臟毒性。

丁哌卡因能夠通過影響能量代謝、鈉離子、鉀離子通道的快結合和慢解離引起傳導延遲，進而引起竇性心動過緩、心搏驟停及房室傳導阻滯等〔14～16〕。除此之外，丁哌卡因能夠通過影響中樞神經系統平衡、NMDA-Ca2+-NO通路產生中樞神經毒性〔17，18〕。NO作為體內一種重要氣體信號分子，其在保護心臟和減輕心臟毒性方面具有重要的作用，如臨床通過提供外源性NO保護缺血受損的心肌細胞〔19〕。本研究表明七葉蓮花醇提物預處理能夠在毒性反應開始期和反應末期，機體進入循環塌陷時顯著提高機體的NO和NOS水平，從而提高局麻藥心臟毒性末期的搶救成功率。

NMDA受體是中樞神經系統中主要的興奮性神經遞質谷氨酸敏感的陽離子通道受體，屬于配體門控型離子通道的超家族，NMDA受體受電壓和配體雙重門控、對Ca2+有較強通透性，該受體活性的維持是神經元存活和發育的重要因素〔20〕。NMDA受體廣泛分布于大腦皮層、海馬、丘腦、紋狀體、小腦及腦干等中樞神經系統，以海馬組織最為密集。在已發現NMDA受體的7個亞單位，即NRl亞單位(NMDA1)、4種NR2亞單位(NR2A、NR2B、NR2C和NR2D)以及2種NR3亞單位(包括NR3A和NR3B)，研究表明NR1缺失能夠引起大鼠的前腦、尾狀核、殼核、海馬和丘腦區代謝活動降低〔21〕。NR2亞單位是修飾蛋白，不能單獨形成功能性受體，具有功能性的NMDA受體必須是NRl亞基與一種NR2或NR3亞基形成的復合物〔22〕。臨床上，丁哌卡因能夠引起嚴重的興奮性神經毒性，NMDA受體是介導興奮性神經毒性的主要受體〔23〕，本研究結果表明在泵注丁哌卡因之前，用七葉蓮花醇提物預處理能夠顯著下調大鼠海馬組織NMDA1和NMDA2B表達。因此，預先給予七葉蓮花醇提物能夠下調丁哌卡因大鼠海馬組織中NMDA受體的表達和活化。

綜上，七葉蓮花醇提物減輕丁哌卡因靜脈注射產生的心臟毒性與中樞神經毒性反應可能與下調NMDA受體表達及提高NOS活性相關，但是中藥成分復雜，作用靶點廣泛，所以不能夠確定七葉蓮花醇提物減輕丁哌卡因大鼠中樞神經毒性反應和心臟毒性的主要活性成分，也不能夠排除其他作用機制。因此，后續研究仍需進一步探索有效成分及相關機制。