沙棘黃酮對大鼠動脈粥樣硬化斑塊的影響及作用機制

焦艷 謝世靜 李喆

(滄州醫學高等專科學校藥學系，河北 滄州 061000)

動脈粥樣硬化(AS)是冠心病、腦血管疾病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎，但目前AS的發病機制尚未完全清楚〔1〕。他汀類藥物是AS治療的基石，但存在藥物不良反應。沙棘黃酮(TFH)是從中藥沙棘中提取出的主要有效成分，具有增強免疫、抗氧化、保護心血管系統等作用。研究發現，TFH可通過降低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶蛋白表達及升高去乙?；?SIRT1)蛋白表達，提高機體防御氧化應激能力〔2〕。由于目前關于TFH對AS大鼠斑塊影響的相關研究較少，因此本文就TFH對大鼠AS斑塊的影響及機制進行探討。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，8月齡，體重200～220 g，購于第四軍醫大學動物實驗中心，動物合格證號為SCXK(軍)2015-0014。主要試劑：TFH(青?？灯盏律镏破酚邢薰?，純度≥95%)；阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業股份有限公司，批號：110808，規格：10 mg/片)；維生素D3滴劑(上海通用藥業股份有限公司，批號:121125，規格：30萬IU：1 ml)；CD4+、CD8+單克隆抗體(美國Biolegend公司)；Smad3抗體(英國Abcam公司)；免疫組化試劑盒(德國Thermo Fisher Scientific公司)等。主要儀器：RM2125型Leica石蠟切片機(德國Leica公司)；1-15K型高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；BH-2光學顯微鏡(日本Olympus公司)；XL20全自動生化分析儀(德國Thermo Fisher Scientific公司)；FACS Calibur型流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)等。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型建立〔3〕、分組及處理 實驗分為對照組、模型組、陽性對照組及實驗組5組，每組25只。模型組、陽性對照組及實驗組大鼠均按60萬IU/kg的總劑量腹腔注射維生素D3，注射3 d，同時給予高脂飼料喂養8 w，建立大鼠AS模型。造模第8周末，隨機抽取各組5只大鼠，取主動脈組織做病理切片，出現主動脈內膜增厚，血管內有斑塊形成，并伴有脂質沉積的現象，說明造模成功。各組均剩余造模成功大鼠各20只，陽性對照組給予阿托伐他汀鈣10 mg/(kg·d)灌胃，實驗組給予TFH 200 mg/(kg·d)灌胃，對照組與模型組則使用等量生理鹽水灌胃，各組均連續給藥4 w。

1.2.2全自動生化分析儀〔4〕檢測各組血脂水平 末次干預結束后，大鼠均禁食24 h，給予戊巴比妥鈉30 mg/kg行腹腔麻醉，自心臟心室處插管，用紅色生化管采集動脈血10 ml，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，裝于離心管，用于血脂檢測。應用XL20全自動生化分析儀檢測以下血脂指標水平，即血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.2.3流式細胞儀法〔5〕測定各組血清T淋巴細胞亞群水平 末次干預結束后，血液采集同1.2.2，采集好的血液標本，加入EDTA-K2抗凝，加熒光素標記的抗CD4+、CD8+單克隆抗體80 μl，室溫孵育15 min，制備待測樣本，流式細胞儀用前向角測向角設二維點圖，用Gatel將淋巴細胞圈住，檢測Gatel內細胞10 000個，使用CELL QUEST軟件獲取熒光信號并分析CD4+、CD8+T細胞百分比。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色〔6〕觀察大鼠主動脈病理學形態 末次干預結束后，將各組大鼠放置于操作臺上，給予麻醉后將小鼠斷頭處死，75%酒精消毒，解剖取出頸部主動脈，200 ml甲醛溶液固定后，不同濃度乙醇脫水，采用石蠟包埋制作常規石蠟病理切片，使用 HE染色，于光學顯微鏡下觀察主動脈病理學變化情況。

1.2.5免疫組織化學法〔7〕檢測Smad3表達情況 末次干預結束后，主動脈組織采集同1.2.4。采用免疫組化法，嚴格按試劑盒說明書進行。按1∶100將Smad3抗體稀釋，4℃冰箱過夜。室溫下放置60 min，滴加二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體〕50 μl，37℃孵育30 min；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。在光學顯微鏡下觀察棕黃色顆粒為陽性表達，每張切片在光鏡下隨機選6個不同視野，采用BI-2000圖像分析系統計算Smad3蛋白陽性表達細胞數，與總細胞數之比即為陽性細胞百分比。

1.3統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組血脂水平比較 與對照組相比，其余3組血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高，而HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組及實驗組TC、TG、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)；與陽性對照組比較，實驗組TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清血脂、T淋巴細胞亞群水平比較

2.2各組血清T淋巴細胞亞群水平比較 與對照組相比，其余3組血清CD4+、CD4+/CD8+顯著降低，CD8+顯著升高；與模型組相比，陽性對照組及實驗組CD4+與CD4+/CD8+顯著升高，CD8+顯著降低(P<0.05)；與陽性對照組比較，實驗組CD4+、CD4+/CD8+顯著降低，CD8+顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組主動脈病理學形態 對照組主動脈血管壁結構清晰，內膜完整，無脂質沉積，無斑塊形成，且表面無炎性細胞浸潤；模型組主動脈內膜結構破壞，動脈內膜增厚、可見血管內斑塊形成，并伴有炎性細胞浸潤及脂質沉積；陽性對照組及實驗組主動脈內膜結構稍有破壞，內膜纖維帽增厚，斑塊病變程度及病變面積、范圍均較模型組減輕、減小，且斑塊穩定性增加。見圖1。

圖1 光學顯微鏡下觀察主動脈的病理學形態(HE，×200)

2.4各組大鼠主動脈中Smad3表達情況 對照組、模型組、陽性對照組及實驗組主動脈斑塊Smad3蛋白陽性細胞百分比分別為(16.12±4.63)%、(87.26±3.91)%、(39.73±4.82)%、(51.02±5.38)%。與對照組相比，其余3組Smad3蛋白陽性細胞百分比顯著升高，與模型組相比，陽性對照組及實驗組Smad3蛋白表達顯著降低，且陽性對照組顯著低于實驗組(P<0.05)。見圖2。

圖2 主動脈斑塊中Smad3蛋白表達(免疫組化，×400)

3 討 論

脂代謝異常和血清中生長因子水平異常是AS的重要危險因素，同時，T淋巴細胞作為免疫因素在AS發生、發展過程中的作用越來越受到重視〔8〕。TFH有活血化瘀、調節血脂蛋白、抗腫瘤等藥理功效。研究發現，TFH可以顯著調節實驗性高脂血癥大鼠血脂水平〔9〕。TFH可顯著降低高脂飼料喂養大鼠的血脂水平，調節脂質代謝紊亂，減少肝細胞中脂肪變性〔10〕。本研究結果提示TFH可降低AS大鼠血脂水平，降低脂肪變性。研究發現，正常人的動脈管壁罕見T淋巴細胞浸潤，而AS斑塊可見T淋巴細胞活化，CD4+T淋巴細胞增多，在不穩定斑塊中，CD8+T淋巴細胞增多〔11〕。本研究結果提示TFH可調節T淋巴細胞亞群分布，提高細胞免疫功能。Smad3是參與AS炎癥信號的重要通路之一，研究表明白細胞介素(IL)-37和Smad3在AS斑塊中表達增高，并推測IL-37/Smad3可能參與AS的調節過程〔12〕。本研究結果提示TFH可降低Smad3表達，進而改善AS。