表柔比星固體脂質納米粒的制備及透黏膜行為*

趙 寧,李偉澤,付麗娜,王小寧,馬 秀,任菲菲

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

表柔比星(Epirubicin hydrochloride，EPI)為蒽醌類抗腫瘤藥，具有廣譜、高效的特點，主要用于乳腺癌、惡性淋巴瘤、軟組織肉瘤和胃癌等的治療。因表柔比星原藥在外部環境下不穩定,市售表柔比星一般以其鹽酸鹽形式存在。EPI對不同生長周期的細胞均可產生抑制DNA、RNA和蛋白合成的細胞毒作用。目前中國使用的劑型以凍干粉和水針劑為主，但常規制劑存在靶向性差的弊端，不能選擇性地區分腫瘤細胞和正常細胞,不良反應較多，存在嚴重的心臟毒性和骨髓抑制作用。其次，透生物膜能力差，生物利用度低，這些缺點一定程度限制了其臨床應用[1-2]。

固體脂質納米粒(Solid lipid nanoparticles,SLNs)是一種新型的實體骨架微粒給藥系統，粒徑約為20～1 000 nm。通常以室溫下固態的天然或合成的脂質、類脂為基質，將藥物包裹于類脂核中，與傳統的脂質體相比，有效解決了藥物容易泄漏的缺點，同時也避免了載體的物理不穩定性。因其所用基質多為人體耐受性良好的脂質材料，具有良好生物相容性和生物可降解性，且能有效提高藥物的生物利用度，增加藥物在體內的吸收和靶向性，延緩藥物釋放。同時SLNs成本低，利于大規模生產，目前已成為微乳、脂質體、聚合物納米粒等的替代品[3-5]，因此具有良好應用前景。作者研究了以復乳法制備EPI-SLNs的處方及成型工藝，并考察了EPI-SLNs體外釋藥及透黏膜行為。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

鹽酸表柔比星原料藥：質量分數≥98%，大連美侖生物技術有限公司；鹽酸表柔比星標準品：批號130560-200501，中國食品藥品檢定研究院；大豆卵磷脂：上海太偉藥業有限公司；單硬脂酸甘油酯、硬脂酸：南昌華鑫醫藥化工有限公司；普朗尼克F-68：天津市科密歐化學試劑有限公司；膽固醇：安徽科寶生物工程有限公司；膽酸鈉：東京化成工業株式會社；聚氧乙烯40單硬脂酸酯：江蘇省海安石油化工廠；色譜乙腈、色譜甲醇：美國Honeywell；其他試劑均為分析純，市售；水：雙蒸水，自制。

高效液相色譜儀：Agilent1260，美國安捷倫科技有限公司；掃描電鏡：ZEISS Gemini 300，德國蔡司公司；透射電鏡：JEM-2100F，日本電子株式會社；激光粒度儀：ZEN-3600，英國馬爾文公司；離心機：Allegra 64R Centrifuge，美國BECKMAN公司；分析天平：Quintix224-1CNsartorius，賽多斯科學儀器北京有限公司；高速分散勻質機：FJ-200，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EPI含量測定方法的建立

采用高效液相色譜儀，在色譜柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為V(乙腈)∶V(水)=37∶63，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為233 nm，進樣量為20 μL的色譜條件下，對制劑中EPI含量進行檢測，建立標準曲線，并進行方法學考察[6]。

1.2.2 EPI-SLNs的包封率測定方法

采用冷凍高速離心法測定包封率，精密吸取制好的EPI-SLNs 2 mL,經高速冷凍離心機，t=10 ℃、n=13 500 r/min離心60 min，取上清液1 mL置于2 mL容量瓶中，甲醇定容，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液20 μL，測定游離EPI藥量，包封率計算見式(1)。

(1)

1.2.3 EPI-SLNs的制備

(1)制備方法。制備固體脂質納米粒的方法較多，有復乳法、微乳超聲法、高速勻質法等，經前期預實驗篩選，以復乳法所得固體脂質納米粒粒徑、電位及包封率較好，因此實驗以復乳法制備表柔比星固體脂質納米粒。具體制備步驟如下。稱取11 mg單硬脂酸甘油、3.5 mg大豆卵磷脂置于25 mL燒杯中加入3 mL乙酸乙酯作為油相，稱取1 mg EPI、5 mg膽酸鈉溶于適量的蒸餾水中作為水相，油相、水相分別置于70 ℃水浴中，使其溶解，后將水相緩慢加入油相，渦旋30 s，超聲20 s使其形成W/O型初乳，再加入8 mL質量分數為0.1%泊洛沙姆188和質量分數為0.25%賣澤-52中超聲90 s得W/O/W復乳，將復乳分散到質量分數為0.1%泊洛沙姆188的4 mL水溶液中，旋轉蒸發除去有機溶劑，即得。

(2)EPI-SLNs的處方優化。藥物包封率是衡量SLNs制劑質量好壞的重要指標，也是其能夠發揮較普通制劑高效、低毒的關鍵。以SLNs的包封率為評價指標，考察在制備過程中m(單硬脂酸甘油酯)(2、3.5、5、8、11 g)，m(大豆卵磷脂)(1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mg)，V(油相)∶V(水相)(2、3、4、5、6)對EPI-SLNs包封率的影響。

(3)EPI-SLNs的工藝優化。乳化過程對EPI-SLNs的成型至關重要，考察了制備過程中初乳的渦旋時間(20、30、40、50、60 s)、初乳超聲時間(10、20、30、40、50 s)與復乳超聲時間(30、60、90、120、150 s)對EPI-SLNs包封率的影響[7-11]。

1.2.4 EPI-SLNs藥劑學性質考察

(1)包封率測定。按照上述篩選的最優處方及最佳工藝制備3批EPI-SLNs，其外觀均勻一致，t=4 ℃存放，備用。按1.2.2方法測定其包封率。

(2)粒徑及電位測定。將按最優處方和工藝制備的EPI-SLNs適量，置于50 mL燒杯中，按照V(EPI-SLNs)∶V(純凈水)=1∶10稀釋，經馬爾文激光粒度儀測定其粒徑及電位[12-14]。

1.2.5 EPI-SLNs的體外釋藥行為考察

采用平衡透析法考察EPI-SLNs的體外釋放特性。取所制備的EPI-SLNs混懸液10 mL置于經處理的透析袋中，兩端扎緊，置于50 mL的生理鹽水中，于恒溫磁力攪拌器上，設定t=37 ℃、n=450 r/min，分別在t=0、1、2、4、8、12、24 h取樣1 mL并及時補充等量的生理鹽水，樣品經0.22 μm微孔濾膜過濾，經HPLC檢測，計算EPI的累積釋藥量。以藥物累積釋放率為縱坐標，時間為橫坐標作圖，同法以EPI水溶液為對照[15]。

1.2.6 EPI-SLNs的體外透黏膜行為考察

采用立式擴散池法考察EPI-SLNs的體外透黏膜行為，具體操作如下。將處理好的豬小腸固定于接收池和供給池之間，黏膜側面向供給池，供給池中加入所制備的EPI-SLNs，接收池中以7.0 mL的生理鹽水作為接收液。分別在給藥后t=1、2、4、8、12、24、36 h分別精密吸取接收液1.0 mL，并補加等量的新鮮生理鹽水，樣品經0.22 μm微孔濾膜過濾，取20 μL注入HPLC測定EPI的含量。以EPI水溶液作為對照組，同法操作。各時間點的藥物累積透過率見式(2)。以累積透過率為縱坐標，時間為橫坐標作圖[16-17]。

(2)

式中：Q為藥物累計釋放質量占總質量的百分數,%；ρi為第i次所取樣品的質量濃度，mg/L；V為釋放介質總體積，mL；Vi為取樣體積，mL；m為藥物總質量，mg。

1.2.7 EPI-SLNs的黏膜滯留量考察

在透黏膜實驗36 h后，將腸黏膜取下，晾干后稱量并剪碎，置于燒杯中，加入8 mL生理鹽水，超聲30 min，移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，轉移至離心管中，t=10 ℃、n=13 500 r/min離心30 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜后，經HPLC測量黏膜中滯留藥物的含量。

2 結果與討論

2.1 EPI含量測定的方法學考察結果

2.1.1 標準曲線的建立

精密稱取EPI標準品1.000 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得20 μg/mL的EPI儲備液，備用。精密吸取儲備液0.039、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5 mL分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到質量濃度為7.8、15.6、31.2、62.4、125、250、500 μg/mL的系列標準品溶液，分別標為1～7號，經0.22 μm微孔濾膜，取20 μL，按照1.2.1色譜條件測定,以峰面積A為縱坐標，以質量濃度ρ為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程y=61.415x+90.228，R2=0.999 2，表明ρ(鹽酸表柔比星)=7.8～500 μg/mL線性關系良好。

2.1.2 方法學考察

(1)精密度實驗。取EPI 3號標準品溶液20μL，按1.2.1色譜條件測定峰面積，連續進樣6次，考察精密度，結果峰面積積分值的RSD為0.2%，精密度良好(n=6)。

(2)穩定性實驗。取EPI 4號標準品溶液室溫下放置，分別于t=0、3、6、12、24、48 h取20 μL注入HPLC，按照1.2.1色譜條件測定其峰面積，峰面積積分值的RSD為0.02%，表明鹽酸表柔比星在t<48 h穩定性良好。

(3)重復性實驗。精密吸取制好的EPI-SLNs 2 mL,置于2 mL離心管，t=10 ℃、n=13 500 r/min離心60 min，取上清液1 mL置于2 mL容量瓶中，甲醇定容，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取20 μL按照1.2.1色譜條件測定峰面積，連續進樣6次，考察重復性，結果峰面積積分值的RSD為1.61%，重復性良好(n=6)。

(4)回收率實驗。取9份空白固體脂質納米粒1 mL，置于2 mL離心管內，分為3組，分別加入62.5、125 L、250 μg/mL EPI標準品溶液1 mL，t=10 ℃、n=13 500 r/min離心30 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，進HPLC按照1.2.1色譜條件測定，測得平均回收率為98.8%，峰面積積分值的RSD為2.91%。

2.2 EPI-SLNs的處方及工藝優化結果

2.2.1 EPI-SLNs的處方優化結果

單硬脂酸甘油酯是制備SLNs的主要脂質材料，其用量對SLNs的質量具有重要影響，見圖1(n=3)。

m(單硬脂酸甘油酯)/mg

由圖1可知，當m(單硬脂酸甘油酯)=5 mg，EPI-SLNs的包封率為62.5%，此后包封率隨著m(單硬脂酸甘油酯)增加而降低；推測原因可能為在SLNs的制備過程中，藥物與脂質存在一定的容納比例，因此通過增大脂質材料的用量，提高納米粒對藥物的包封率具有一定限度，且在制備中發現當處方中m(單硬脂酸甘油酯)過大，形成的SLNs混懸液中存在脂質析出的現象。

大豆卵磷脂對于初乳的形成至關重要，影響到SLNs的成型性及包封率，見圖2(n=3)。

m(大豆卵磷脂)/mg

由圖2可知，隨著m(大豆卵磷脂)的增加，EPI-SLNs的包封率呈現先上升后緩慢降低的趨勢，m(大豆卵磷脂)=3.5 mg，包封率達到最大為65.9%，推測當m(大豆卵磷脂)較小時，不能夠完全乳化硬脂酸甘油酯，故包封率較小，m(大豆卵磷脂)=3.5 mg，體系中磷脂已足夠乳化油相，形成穩定的初乳，因此當m(大豆卵磷脂)繼續增大，包封率不再明顯增大，且當體系中大豆卵磷脂濃度過大，可能形成較多的大小不一的磷脂囊泡，也將影響SLNs的質量及外觀形態。

研究表明，當油相組成、載體材料濃度確定后，V(油相)∶V(內水相)也會影響SLNs的包封率，見圖3(n=3)。

V(油相)∶V(內水相)

由圖3可知，EPI-SLNs的包封率隨著V(油相)∶V(內水相)的增加呈先上升后下降的現象，當V(油相)∶V(內水相)=5，包封率達到最大為66.7%，在實驗中也發現當V(油相)∶V(內水相)較小時，制得的SLNs易膠凝，當V(油相)∶V(內水相)過大時，制得的SLNs混懸液有藥物結晶析出。

2.2.2 EPI-SLNs的工藝優化結果

乳化過程對EPI-SLNs的成型至關重要。考察了制備過程中初乳的渦旋時間、初乳超聲時間與復乳超聲時間對EPI-SLNs包封率的影響，結果見圖4～圖6(n=3)。

初乳渦旋時間/s

由圖4可知，制備初乳時，渦旋30 s，SLNs包封率為69.3%，之后隨著渦旋時間的延長，包封率下降，推測原因為渦旋是將體系快速混合，為乳化的準備步驟，其所提供的能量不足以形成均勻穩定的乳劑，因此渦旋時間過長，導致體系中油相、內水相的不完全乳化將不利于后續操作。

由圖5可知，初乳超聲時間為40 s，SLNs包封率為69.5%，繼續延長超聲時間，包封率下降，推測原因為超聲40 s時初乳已形成，此時體系中乳滴密度較大，繼續提供較大能量將導致乳滴的碰撞、合并，影響藥物包封率。

初乳超聲時間/s

由圖6可知，復乳超聲時間為60 s，SLNs包封率為72.3%，繼續延長超聲時間，包封率降低，推測原因為此時復乳已經形成，若超聲時間過長，將易破壞復乳結構，引起內水相的外溢，因此影響包封率。

復乳超聲時間/s

綜上，得到最佳制備處方及工藝為m(單硬脂酸甘油酯)=5 mg、m(大豆卵磷脂)=3.5 mg，V(油相)∶V(內水相)=5，初乳渦旋時間30 s，初乳超聲時間40 s，復乳超聲時間60 s。

2.3 EPI-SLNs藥劑學性質考察結果

2.3.1 EPI-SLNs的包封率

按照篩選的最優處方及最佳工藝制備3批EPI-SLNs，其外觀均勻一致，t=4 ℃存放、備用。測定其包封率，結果見表1。

表1 包封率測定結果

2.3.2 EPI-SLNs的粒徑及電位

取最優處方和工藝制備的EPI-SLNs適量，置于50 mL燒杯中，按V(EPI-SLNs)∶V(純凈水)=1∶10稀釋，經馬爾文激光粒度儀測定，其平均粒徑為148.6 nm，粒徑PDI為0.259。粒徑分布均勻，平均電位為-30.8 mV，一般而言，當粒子表面電位的絕對值大于30 mV時，由于粒子表面存在大量凈電荷，納米粒子之間存在較大的靜電斥力而有利于制劑的穩定性，見圖7、圖8。

d/nm

U/mV

2.4 EPI-SLNs的體外釋藥行為考察結果

采用平衡透析法考察EPI-SLNs的體外釋放特性，見圖9(n=3)。

t/h

由圖9可知，t=8 h EPI水溶液的釋放度已達90%，高于EPI-SLNs，EPI-SLNs呈現明顯的緩釋作用。EPI-SLNs的體外釋藥在初期存在突釋現象，t=1 h體外累積釋放度達到了20.17%，t=4 h為45.02%，推測該階段釋放較快與藥物在SLNs中的分布有關，在EPI-SLNs的制備中，部分藥物可能以分子或細小粒子形式分布于納米粒骨架結構的表層或淺表層，而未進入內核，這些藥物用藥可較快釋放，表現為突釋。此后EPI釋放逐漸緩慢，t=8 h累積釋放度達65.02%，該階段主要是脂質基質逐漸被釋放介質溶蝕，藥物則通過擴散緩慢從剛性基質結構中釋放，故顯示明顯的緩釋。

2.5 EPI-SLNs的體外透黏膜行為考察結果

采用立式擴散池法考察EPI-SLNs的體外透黏膜行為，見圖10(n=3)。

由圖10可知，EPI-SLNs與其水溶液相比黏膜滲透能力具有明顯優勢，t=8、12、36 h，EPI-SLNs的黏膜累積透過率分別為48.4%、55.12%、62.08%，為EPI水溶液的2、1.96、1.79倍，表明EPI-SLNs具有更好的黏膜透過性，因此可推測制備成EPI-SLNs后大大提高了其黏膜滲透能力，有利于藥物在體內的吸收，在一定程度上可提高EPI的生物利用度。

t/h

2.6 EPI-SLNs的黏膜滯留量考察

透黏膜實驗進行36 h后，將腸黏膜取下，按1.2.6方法測量黏膜中滯留的藥物含量，見圖11(n=3)。

圖11 EPI、EPI-SLNs黏膜滯留率

由圖11可知，36 h后EPI-SLNs和EPI水溶液的的黏膜滯留量分別為給藥量的6.97%和13.84%。結合透黏膜行為可知，EPI-SLNs比EPI水溶液更易透過黏膜，而不易在黏膜組織中滯留，在一定程度上可推測EPI-SLNs體內用藥將更利于吸收而毒副作用更小。

3 結 論

制備SLNs常用的脂質材料有單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、棕櫚酸、膽固醇等，作者在前期預實驗中對脂質材料進行了篩選，通過復乳法，以包封率為指標，分別以上述4種材料制備了EPI-SLNs，所得EPI-SLNs包封率分別為59.5%、49.3%、53.8%、55.2%，且以硬脂酸及棕櫚酸為脂質材料制備的SLNs混懸液中常出現載體析出的現象，考慮其包封率較低與載體析出及脂質膠凝有關，故實驗以單硬脂酸甘油酯為制備SLNs的主要脂質材料。SLNs為納米級別給藥體系，為了得到納米級別的粒子，制備過程中需要給予足夠的能量，將脂質材料有效的分散，通常采用超聲或高速攪拌。采用復乳法制備了EPI-SLNs，體外釋藥行為顯示EPI-SLNs具有明顯的緩釋效果，體外透黏膜實驗顯示EPI-SLNs相較于其水溶液具有更強的黏膜滲透能力，因此，在一定程度上可預測EPI-SLNs相較于傳統制劑，在體內發揮藥效更加持久，且更有利于藥物的吸收以及生物利用度的提高，因此EPI-SLNs具有廣闊的應用前景。