廠形葉幕赤霞珠葡萄果實蘋果酸的代謝規律

周曉明，張付春，鐘海霞，張 雯，韓守安，伍新宇，潘明啟

(新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】酒石酸與蘋果酸是葡萄果實中最重要的有機酸，是轉色期前葡萄漿果中積累的主要可溶性有機成分，兩者占漿果總酸的70%～90%[1]。葡萄果實中酒石酸的積累代謝相對穩定。蘋果酸積累與分解受環境因素影響較大，特別是轉色期前后及成熟期的氣候條件[2]。新疆葡萄栽培產區存在成熟期短且氣溫較高等現象，導致釀酒葡萄的酸度相對偏低。研究葡萄果實中蘋果酸等有機酸的代謝規律，對葡萄品質調控技術的改良有重要意義。【前人研究進展】蘋果酸(malic acid, malate)是一種四碳二羧酸,參與許多細胞代謝, 還作為碳素和還原力載體在細胞質與細胞器以及細胞器之間傳遞碳素和還原力。轉色前期蘋果酸的積累主要依靠糖代謝轉運至漿果內以及潛在的漿果光合作用生成[3]。轉色后期蘋果酸從液泡中釋放出來并參與各類分解代謝反應，包括TCA循環、呼吸作用、糖異生反應、氨基酸互化、乙醇發酵，以及產生系列復雜的此生代謝產物如花色苷和黃酮醇[4-6]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)、蘋果酸酶(NADP-ME)是果實參與蘋果酸代謝的3種關鍵酶[7-9]。PEPC能利用碳酸根將PEP縮合成OAA。其活性在漿果發育早期一直保持較高水平，其變化與蘋果酸含量積累變化相一致，在漿果成熟開始之前其活性迅速降低。MDH能催化OAA與蘋果酸之間的可逆反應，并維持二者之間的平衡。ME能夠降解蘋果酸并將其脫羧變為丙酮酸，催化二者的可逆反應，在葡萄[10]、蘋果[11]、梨[12]等果實上的研究結果表明，NADP-ME活性與蘋果酸含量呈負相關。對櫻桃[13]、歐洲李[14]的果實發育研究，均表明NAD-MDH和NADP-ME 活性分別與蘋果酸含量呈極顯著的正、負相關，其共同作用造成了不同品種果實中蘋果酸的積累差異。葉幕形對葡萄果實的品質有較大的影響。不同的葉幕高度[15]、厚度處理[16]，可以改變葡萄的光合作用效率及果實生長區域微氣候環境，影響葡萄的果實品質。楊君[17]比較了直立葉幕和V形葉幕下赤霞珠葡萄的果實品質，發現V形葉幕果實著色較好，單株產量、可溶性固形物含量以及果皮的總黃烷醇、總花色苷含量均高于直立葉幕。【本研究切入點】在廠形樹形的基礎上進行簡約化的葉幕形處理，從而達到調控葡萄果實蘋果酸代謝方面的研究至今鮮有報道。需研究不同葉幕形果實蘋果酸等有機酸的積累代謝及蘋果酸相關代謝酶活性的變化規律。【擬解決的關鍵問題】在廠形樹形的基礎上，設置對照直立形葉幕及2種高度的廠形葉幕，研究葉幕微氣候調控對赤霞珠葡萄果實蘋果代謝的影響及作用規律，為釀酒葡萄品質的精準化調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

采樣地點位于新疆烏魯木齊市新疆農業科學院安寧渠試驗場。葡萄為單主干樹形廠形架勢，2011年定植，南北行向，株行距1 m×3 m。

2017年7月19日～9月8日采樣。每隔10 d采樣1次，分別為葡萄盛花期后35 d(7月19日)、45 d(7月29日)、55 d(8月8日)、65 d(8月18日)、75 d(8月28日)、85 d(9月7日)、95 d(9月18日)。

每個單株分東西面各選2個果穗，從1個果穗的上、中、下共采5～8粒果實，混合樣分3份即為3個重復。果實采摘后立即用冰盒帶回實驗室，液氮速凍，破碎去除種子，于-40℃保存待測。

1.2 方 法

1.2.1 葉幕處理

盛花期后25 d(2017年7月9日)，在廠形樹形架勢的基礎上，設置頂端向西側生長型廠形葉幕H1及H2，二者頂端葉幕分別為距地面1.5 m及1 m。CK為對照處理，即直立形葉幕，頂端葉幕高度1.2～1.5 m。每種葉幕處理10株葡萄。3種葉幕形樹體生長過程簡約化修剪，保持葉果比相對一致，盡可能減少其他因素的交互影響。圖1

圖1 3種葉幕形示意Fig.1 Schematic diagram of three canopy types

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 酸組分

采用HPLC方法并參考林耀盛[18]的方法并進行優化。

檢測儀器及色譜條件：島津LC-20A高效液相色譜儀(配紫外檢測器)，Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)。流動相為甲醇與0.01 mol/L磷酸氫二銨緩沖液(3:97，磷酸調整pH=2.6)，檢測波長210 nm，柱溫25℃，流速0.5mL/min，進樣量10 μL。酒石酸、蘋果酸、檸檬酸在10 min內出峰完成。

1.2.2.2 酶活性

酶液的制備參照Hirai[19]及史娟[20]的方法。取3 g果肉用3 mL 研磨液在冰浴下研磨(4℃)，4 000 r/min離心20 min，取上清液定容至5mL，加入等體積(5 mL)提取液，即得NAD-MDH和NAD-ME 酶液，取4 mL在提取緩沖液中4℃透析過夜，即得PEPC 酶液。各項操作均在 0～4℃下進行。研磨緩沖液：0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.2，0.6 mol/L蔗糖，10 mmol/L異抗壞血酸。提取緩沖液：0.2 mol/L Tris-HCl，pH8.2，10 mmol/L 異抗壞血酸，0.1% TritonX-100。

酶活性測定參考Hirai[19]及羅安才[21]等的方法。酶活性以U/(min·g)FW表示。

1.2.2.3 其他成分

果域微環境溫度：分別在3種葉幕處理的葡萄結果區域放置高精度溫度測量儀(路格L90-1)，每1 h記錄1次溫度變化。當地氣象站所測氣溫的日均溫度作為環境溫度以作參照。

總酸(TA)：參照國際《GB/T 12456-2008 食品中總酸的測定》的方法，結果以酒石酸計。

可溶性固形物(TSS)：ATAGO PAL-1數顯糖度計測定。

1.3 數據處理

利用SPSS 26.0對數據進行分析。使用Origin2020作圖。

2 結果與分析

2.1 果域微環境的溫度變化

研究表明，溫度變化為CK>H1>環境溫度>H2。環境溫度、CK、H1、H2的均溫分別為 23.3、24.2、23.4和22.7℃。CK的果域溫度高于環境溫度和其他處理。H1的果域溫度比CK低0.8℃，H2果域溫度比CK低1.5℃，H1的果域溫度比H2高0.7℃。

H1與H2的葉幕處理一定程度上起到了降低果域溫度的效應。H1果域溫度高于H2。圖2

圖2 果域微環境的溫度變化Fig.2 Temperature change of the fruit-zone microenvironment

2.2 不同葉幕形有機酸含量變化

研究表明，L-酒石酸與L-蘋果酸在花后35～85 d的過程呈現持續下降趨勢，花后45～55 d變化幅度最為劇烈，該時段也是赤霞珠葡萄的轉色期。花后95 d L-酒石酸含量極小幅度的增高可能與成熟末期果實失水有關。赤霞珠果實的檸檬酸含量較低，在果實發育過程中呈現不規則變化，H1處理在較小范圍有含量略高于其他處理的趨勢。

成熟過程果實可溶性固形物含量呈現持續上升趨勢，在轉色期出現較大幅度的上升。酒石酸與檸檬酸占到總酸的82%～95%，二者是葡萄果實最主要的有機酸。總酸含量的變化趨勢與這2種酸的含量變化也基本一致。

CK處理的葡萄果實酒石酸、蘋果酸含量整體下降的幅度大于H1與H2處理。花后95 d，H1、H2處理的酒石酸含量分別為4.684、4.670 mg/g，比CK處理分別高0.774、0.760 mg/g；H1、H2處理的蘋果酸酸含量分別為1.038、1.065 mg/g，比CK處理分別高0.338、0.365 0 mg/g。H1與H2的葉幕處理與CK相比，一定程度上提高了果實酒石酸與蘋果酸的含量，成熟過程H1處理的果實酒石酸與蘋果酸含量整體呈現略高于H1的趨勢，但差別極小。花后95 d H2處理果實蘋果酸含量呈現高于H1的情況，但也僅為0.027 mg/g。圖3

圖3 不同葉幕形葡萄果實有機酸含量變化Fig. 3 Changes of organic acids in grape fruits with different canopy types

2.3 不同葉幕形蘋果酸代謝相關酶活性的變化

研究表明，果實PEPC酶活性在成熟過程整體呈現下降的趨勢。該酶參與的蘋果酸合成的作用可能逐漸減弱。

果實NAD-MDH酶活性在成熟過程也整體呈現下降趨勢。45～55 d時，大幅度的下降，該時期是赤霞珠葡萄轉色的關鍵時期。此時期的果實蘋果酸含量也有較大幅度的下降，該酶活性的降低可能對蘋果酸合成有較大影響。

NADP-ME酶活性在果實成熟過程中前期呈現較明顯的上升趨勢，中后期出現小范圍的下降。該酶與蘋果酸的分解有關，轉色期赤霞珠果實蘋果酸較大幅度的下降與該酶在這一階段的變化有較一致的正相關趨勢。圖4

2.4 蘋果酸代謝相關酶活性與蘋果酸含量及果域溫度變化的相關性

研究表明，CK處理與PEPC酶活性、H2處理與NAD-MDH酶活性達到極顯著正相關。CK處理與NAD-MDH酶活性顯著正相關，與NADP-ME酶活性顯著負相關。H1處理與PEPC酶活性及NAD-MDH酶活性顯著正相關。CK處理與蘋果酸合成代謝酶的相關性較好。表1

表1 蘋果酸相關代謝酶活性與蘋果酸含量相關性Table 1 Correlation between malate-related metabolic enzyme activity and malate content

階段性溫度變化與3種酶活性變化無顯著相關性。NAD-MDH與溫度的正相關性較高，NADP-ME與溫度呈現一定的負相關性。低溫可能不利于NADP-ME的活性升高，低溫帶來的效應可能是減弱蘋果酸的降解。表2

圖4 不同葉幕形葡萄果實蘋果酸代謝相關酶活性變化Fig. 4 Changes of enzyme activities related to malate metabolism in grape fruits with different canopy types

表2 蘋果酸相關代謝酶活性與果域微環境溫度相關性Table 2 Correlation between the activity of malate-related metabolic enzymes and the temperature of the fruit-zone microenvironment

3 討 論

新疆地區的葡萄栽培需要進行埋土防寒，在廠形樹形的基礎上，改變頂端的部分葉幕為西向廠形葉幕，在簡約化的基礎達到了對底部果實的部分遮陰效果，一定程度上改變了果域微環境的溫度。東西雙向的V形葉幕也是改變果域微環境及樹體光合效應[22]的手段之一，但V形葉幕從結果部位以上的葉幕中底部開始改變葉幕形，操作相對較復雜。葡萄是喜陽光的植物，除了葉片的光合效應，果實表面的光照對成分積累及代謝也有較為重要的作用[23]。V形葉幕遮陰作用較強，過早布置還會對果實有機酸等物質的積累產生不利影響[24]。設置西向的廠形葉幕，可以有效降低午后的日照高溫對果域微環境的影響，東向果實仍可接受清晨及上午較為溫和的日光。較早的果實部分遮陰，對有機酸及其他成分積累的影響仍需深入研究。

葉幕形的調整在一定程度上達到了調控蘋果酸等有機酸代謝的目的。PEPC、NAD-MDH、NADP-ME 3種蘋果酸代謝相關酶變化與蘋果酸含量變化呈現出的相關性也與前人[10,25,26]的研究相吻合。3種代謝酶與果域溫度呈現出不同的相關性，但并未達到顯著水平，果實中蘋果酸的代謝可能受更復雜因素的影響。關于不同葉幕造成的樹體光合效應的改變以及不同光照溫度對果實光合物質代謝的影響，研究并未涉及，需要今后進一步的深入研究。

葡萄果實酒石酸的積累代謝雖然相對穩定[27]，但是試驗中發現葉幕形的改變對酒石酸含量可能起到了一定的調控作用。葡萄中檸檬酸含量較低，其代謝可能受多方因素影響[28]，試驗中的葉幕處理對其代謝的影響規律并不十分明確。

4 結 論

廠形葉幕與直立形葉幕相比，降低了赤霞珠葡萄果域微環境的溫度，2種廠形葉幕處理分別降低了0.8℃與1.5℃。廠形葉幕在一定程度上提高了酒石酸與蘋果酸的含量，2種廠形葉幕處理的葡萄果實酒石酸含量分別提高了0.774與0.760 mg/g，蘋果酸含量提高了0.338與0.365 mg/g。3種葉幕下，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶與果實蘋果酸含量呈現不同程度的正相關，蘋果酸酶與果實蘋果酸含量呈現不同程度的負相關。果域微環境溫度與3種酶未達到顯著相關。廠形葉幕處理可以在一定程度上提高赤霞珠果實的有機酸含量，H1高度處理可能是增高果實蘋果酸等有機酸含量的更有利選擇。