中國克虎天牛屬整合分類

郭書含，羅順剛，鐘 問，康 寧，胡紅英

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046)

0 引言

【研究意義】克虎天牛屬Cleroclytus隸屬于鞘翅目Coleoptera、天牛科Cerambycidae，已知種類僅分布于天山山區。中國已記錄2種，即新疆克虎天牛CleroclytuscollarisJakovlev,1885和溝胸克虎天牛CleroclytusstrigicollisJakovlev , 1990[1]，克虎天牛危害樹木生長。在西天山野果林分布的克虎天牛幼蟲鉆蛀、危害野生果樹枝干及根系，導致樹勢衰弱，嚴重時致使樹木迅速枯萎死亡。查明克虎天牛分布及危害狀況，對施以針對性的措施有效預防和遏制其危害有重要意義。【前人研究進展】天牛是危害嚴重且防治困難的一類林木害蟲[2]，天牛的物種鑒定在昆蟲學和林業生態建設上受到廣泛重視[3]。梁鐵等[4]在烏魯木齊發現了溝胸克虎天牛CleroclytusstrigicollisJakovlev(稱為“溝胸細條虎天牛”)危害林木果樹。Danilevsky[5]認為溝胸克虎天牛與分布于新疆伊犁河谷的新疆克虎天牛CleroclytuscollarisJakovlev屬于同一種，二者應為異名，但未提供明確的依據。DNA條形碼技術廣泛應用于昆蟲鑒定、隱存種描述及系統發育分析[6]。Stauffer[7]實現了歐洲7種齒小蠹的快速準確鑒定；鄭斯竹[8]構建了天牛科5個亞科160種的基于COI基因序列的DNA條形碼數據庫，進一步完善了天牛科的快速鑒定技術；陳夢義[9]利用墨天牛屬中的8個種進行COI擴增，依據堿基位點排列和組成差異，區分不同種類；林曉佳[10]應用PCR直接測序法比較不同地理來源的光肩星天牛的線粒體DNA的COI基因，發現美國發生的光肩星天牛并非由中國傳入；李京[11]通過研究天牛科66 種天牛的線粒體基因序列特征，初步弄清楚了各類群之間的親緣關系。天牛科昆蟲雌性生殖器種間差異穩定且明顯，能夠作為物種鑒定的參考。Tanner[12]對7種天牛的雌性生殖器進行了比較形態學研究；Arakawa[13]報道了紫天牛屬Purpuricenus兩種的雌性生殖器，認為雌性生殖器的特征對物種鑒定更為有用；王文凱[14]比較了綠虎天牛屬Chlorophorus的雌性生殖器，認為雌性生殖器結構是可靠的分類依據；任杰群[15]比較了脊虎天牛屬Xylotrechus八個種的雌性生殖器，發現骨桿、交配囊、受精囊的形狀等特征具有重要的分類學意義。【本研究切入點】新疆克虎天牛與溝胸克虎天牛皆分布于新疆，且僅憑形態特征難以區分，是否為同一種也長期存在爭議。目前國內外對于克虎天牛屬物種的研究主要集中在形態分類學方面。新疆地區分布的克虎天牛在形態上缺乏明顯差異，需要使用分子生物學方法加以區分。亟需尋找并明確其分類特征，進而厘清其物種組成。【擬解決的關鍵問題】結合DNA條形碼技術與比較形態學方法，對分別采自新疆烏魯木齊市和伊犁哈薩克自治州新源縣阿勒瑪鄉改良場植物園的克虎天牛進行研究，為其準確鑒定提供依據，并為該屬物種的分類和對其防治相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

新疆克虎天牛成蟲于2017年7月19日采集于新疆伊犁哈薩克自治州新源縣阿勒瑪鄉改良場植物園，溝胸克虎天牛成蟲于2020年6月15日采集于新疆烏魯木齊市新疆大學校內。從GenBank獲得咖啡脊虎天牛Xylotrechusgrayii和暗褐斷眼天牛TetropiumFuscum的3條序列作為外群，用于對比分析。表1，表2

表1 標本采集與保存方式Table 1 Collection and preservation of specimens

1.2 方 法

1.2.1 雌性外生殖器標本的制作、觀察及保存

將克虎天牛成蟲放入100%無水乙醇中使蟲體軟化，標本腹部取下放入清水中煮沸3 min，在解剖鏡下用解剖針取出雌性生殖器；將取出的生殖器放入10%NAOH溶液中煮沸3 min左右(視生殖器的大小和骨化程度而定)，取出放入盛有清水的培養皿中，在解剖鏡下進行分離解剖和清洗，得到潔凈完整的雌性外生殖器[16]，使用體視顯微鏡觀察雌性生殖器的形態特征，并拍照。將雌性生殖器置于木餾油中脫水，再浸置于丁香油中固定，用加拿大樹膠封片永久保存。

表2 使用的GenBank的數據Table 2 The sequence data used in GenBank of thisresearch

1.2.2 DNA提取

將克虎天牛剩余的身體部位置于2 mL離心管中，加入研磨鋼珠后，利用高效組織研磨儀研磨2 min，隨后利用OMEGA試劑盒說明書操作提取克虎天牛DNA。

1.2.3 DNA純度及質量濃度檢測

每個樣品取1 μL DNA于生物分光光度計(NANODrop1000)測定波長260、280 nm的光吸收值(OD)，以無菌水為對照，并自動計算OD260/OD280的比值以及相應DNA濃度值。

1.2.4 目的片段擴增、檢測及測序

選用線粒體基因細胞色素氧化酶I(COI)的部分片段作為分子標記，引物選用擴增該片段的通用引物LCO1490/HCO2198，上游引物堿基序列為：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,下游引物堿基序列為：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

PCR反應體系總體積為25 μL；上、下游引物各1 μL(引物濃度10 μmol/ L)，2×PCR Mix預混液12.5 μL，DNA模板3 μL，用滅菌雙蒸水補足體積至25 μL。擴增程序：94℃預變性4 min，然后進行35個循環，94℃變性1 min，40℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環結束后72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR擴增反應結束后，取2 μL PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳20 min分離擴增產物，電壓120V。電泳結束后, 在UVP凝膠成像系統GDS7600(Gel Documentation Systems)下觀察拍照。委托上海生工生物工程股份有限公司進行PCR產物雙向測序。

1.2.5 目的序列拼接與確認

將各樣品COI序列測序結果導入DNAStar中的SeqMan分析軟件中進行拼接匹配校正。使用DNAMAN軟件分析進行核苷酸序列。通過MEGA 7.0分析計算堿基含量。基于Kimura-2-Parameter模型，用極大似然法(MaximumLikelihood)構建分子系統樹，1 000次循環估計系統樹中節點的自舉置信水平(Bootstrap Confidence Level,BCL)。

2 結果與分析

2.1 新疆克虎天牛和溝胸克虎天牛形態特征

研究表明，從外部形態特征很難將二者區分，僅觸角長和體長比，前胸背板顏色和刻紋等細節存在些微差異 。采自新疆伊犁哈薩克自治州新源縣阿勒瑪鄉改良場植物園的克虎天牛暫定為新疆克虎天牛，采自新疆烏魯木齊市的克虎天牛暫定為溝胸克虎天牛。表3，圖1

2.2 新疆克虎天牛和溝胸克虎天牛雌性生殖器特征比較

研究表明，與大多數天牛一樣，克虎天牛雌性生殖器包括產卵器和內生殖器兩部分，產卵器基部開口為生殖孔。產卵器由肛側板、1對負瓣片、1對基腹片、端突構成。除末端的端突外，其余部分都有堅固的細長骨桿。肛側板骨桿大多較直。基腹片末端分離成兩個近圓柱形的部分，稱為基腹片突。負瓣片位于肛側板的端部，較短。基腹片位于負瓣片下方，在基部左右各有1根基腹片骨桿。內生殖器部分包括受精囊、交配囊等組成。交配囊著生在陰道的前端，呈膜質囊狀。受精囊呈膜質腎形。圖2

注：A：溝胸克虎天牛B：新疆克虎天牛

表3 2種克虎天牛形態特征比較Table 3 Comparison of traditional morphologal charactersoftwo species of Cleroclytus

A：新疆克虎天牛 B：溝胸克虎天牛

表4 克虎天牛屬雌性生殖器特征比較Table 4 Comparison of female genital organs o in

新疆克虎天牛和溝胸克虎天牛肛側板骨桿的雌性生殖器結構非常相似，而新疆克虎天牛比溝胸克虎天牛肛側板骨桿和負瓣片骨桿分段稍為明顯。表4

2.3 DNA質量與濃度比較

研究表明，無水乙醇-20℃冷藏的溝胸克虎天牛濃度較高，針插干標本室溫保存的新疆克虎天牛DNA濃度較低，但DNA樣品OD260/280值均在1.6～1.9。DNA純度達到要求，屬于高質量的DNA，可以達到常規PCR的要求。表5

2.4 克虎天牛COI基因條形碼

2.4.1 COI基因PCR擴增后的電泳結果

研究表明，1～3條帶為新疆克虎天牛，4～6條帶為溝胸克虎天牛。樣本條帶亮度強且單一，無其他帶干擾，且CO I 基因序列分子量為670 bp 左右。圖3

表5 DNA質量與濃度Table 5 The purity and concentration of DNA samples

圖3 克虎天牛COI基因PCR產物電泳Fig.3 Electrophoresis of COIgene PCR products of Cleroclytus

2.4.2 克虎天牛基因組序列組成

研究表明，新疆克虎天牛樣本的A+T含量分別為63.44%、63.64%、63.64%，平均含量是63.57%，各溝胸克虎天牛樣本的A+T含量分別為63.43%、63.63%、63.63%，平均含量是63.56%。各新疆克虎天牛樣本的G+C含量分別為36.56%、36.36%、36.36%，平均含量是36.43%。各溝胸克虎天牛樣本的G+T含量分別為36.57%、36.37%、36.37%，平均含量是36.44%，A+T的平均含量明顯高于G+C的平均含量，表現較強的A/T偏倚，新疆克虎天牛不同樣品基因序列相似性達到99.93%，溝胸克虎天牛不同樣品基因序列相似性達到99.95%。相似性高達99.60%，僅有部分堿基存在差異，測序的新疆克虎天牛與溝胸克虎天牛樣本應屬于同一物種。圖4～6

圖4 三只新疆克虎天牛的COI基因序列對比Fig.4 COI gene sequence comparison between threeCleroclytus collaris Jakovlev

圖5 三只溝胸克虎天牛的COI基因序列對比Fig.5 COI gene sequence comparison between threeCleroclytus strigicollis Jakovlev

圖6 新疆克虎天牛與溝胸克虎天牛的COI基因序列對比Fig.6 COI gene sequence comparison between Cleroclytus collaris Jakovlev and Cleroclytus strigicollis Jakovlev

2.4.3 遺傳距離

研究表明，新疆克虎天牛平均遺傳距離是0.27%，溝胸克虎天牛平均遺傳距離是0.13%，新疆克虎天牛與溝胸克虎天牛平均遺傳距離是0.6%，新疆克虎天牛與溝胸克虎天牛實為同一物種。表6

2.4.4 系統發育樹的建立

研究表明，新疆克虎天牛和溝胸克虎天牛聚為一支，與外群分開。圖7

圖7 基于COI基因序列構建的ML樹Fig.7 Construction of ML tree based on COI gene sequence

表6 各個樣本之間的遺傳距離Table 6 The genetic distance between examples

3 討 論

新疆克虎天牛前胸背板具縱溝紋和刻點，在基半部刻點比縱溝紋占優勢，而溝胸克虎天牛前胸背板上的刻點僅少量分布于后部[1,4,17]。A+T的平均含量明顯高于G+C，表現較強的A/T偏倚，與昆蟲線粒體基因堿基組成的規律相符合[18]。新疆克虎天牛與溝胸克虎天牛平均遺傳距離是0.6%，遺傳距離<2%[19]，Danilevsky[5]認為溝胸克虎天牛與新疆克虎天牛系異名，而陸水田[1]、華立中[20]、王直誠等[21]將其視為2個物種，主要依據在于前胸背板刻紋或刻點。研究結合DNA條形碼技術與形態學比較方法相結合，對新疆克虎天牛與溝胸克虎天牛進行整合分類研究。外部形態以及雌性外生殖器形態解剖未發現明顯形態差異，個別微小差異可認為是個體間差異，序列相似性以及遺傳距離分析均支持二者實為一種，而系統發育樹雖與外群分開，但兩個地點的克虎天牛各聚為一支，可能是由于種內或者地理分布型的差異。

獲取高質量的基因組DNA是開展分子生物學的前提和基礎[22-23]。研究使用的干制克虎天牛標本于室內常溫干制保存，因克虎天牛體壁堅硬，透水透氣性差，從而導致其體內部分DNA降解，可能導致提取自此類標本的DNA濃度較低。從-20℃無水乙醇保存的標本提取出的DNA濃度較高，可能是因為乙醇能夠滲透入昆蟲組織細胞使蛋白質凝固，使多種水解酶喪失活性，降低DNA被分解的程度[24]。分子生物學手段的引入部分降低了分類學研究中對于鑒定者的經驗要求[25]。國內外對DNA條形碼編碼技術進行了廣泛的研究，在昆蟲種類鑒定方面得到了更好的應用[19]。在一定程度上緩解了由于傳統分類學從業者數量減少對生物分類研究的制約[26]。

4 結 論

克虎天牛的COI基因序列長度約為670 bp，新疆克虎天牛與溝胸克虎天牛序列相似性達到99.60%，二者的平均遺傳距離是0.6%，可確定二者為同一種，與形態學鑒定結果基本相吻合。應將溝胸克虎天牛視為新疆克虎天牛的異名，確定分布于伊犁和烏魯木齊的克虎天牛均為新疆克虎天牛。