大孔樹脂純化野山杏總黃酮工藝

金科旭，戴小華，谷虹霏，束佳敏，王天琪，海婷玉

(1.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830091；2.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】野山杏(Armeniacasibirica(L.)Lam.)屬薔薇科李亞科杏屬的亞喬木植物，果肉中含有大量的黃酮類化合物。黃酮類化合物具有降血脂[1]、降血糖[2]、抗氧化[3, 4]、抗菌[5]、鎮痛抗炎[6-7]等藥理作用。從野山杏中提取的總黃酮含量較低。【前人研究進展】野山杏醇提物中總黃酮含量僅為5.39%[9]，影響著野山杏資源的開發利用。大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結構的高分子材料，具有選擇性吸附功能，主要作用于天然植物中活性的分離純化[10, 11]，具有成本低、分離效率高、操作簡單、無毒性、可工業化大批量生產等優點[12]。【本研究切入點】目前對于大孔樹脂純化植物中總黃酮成分的報道很多[13, 14]，但關于大孔樹脂分離純化野山杏總黃酮的研究尚未報道。需要研究優選大孔樹脂分離純化野山杏總黃酮的最佳工藝參數。【擬解決的關鍵問題】采用AB-8、D-101、NAK-9、ADS-17四種大孔樹脂靜態比吸附量及比解吸附量為指標確定純化最佳大孔樹脂，并在此基礎上選出最佳純化條件，為野山杏總黃酮開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

野山杏干燥果肉(新疆哈密伊吾縣)，蘆丁≥98%(上海源葉生物科技有限公司)，D-101、ADS-17、AB-8、NAK-9大孔吸附樹脂(天津市光復精細化工研究所)。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：無水乙醇(天津，)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(分析純，天津市致遠化學試劑有限公司)。

儀器：JBT/C-YCL400T/3P(D) 超聲波藥品處理機(濟寧金百特工程機械有限公司)、RE-52B旋轉蒸發器(上海亞榮化儀器廠)、T6紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、SHB-Ⅲ循環水多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)、HH-S數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫療儀器廠)、DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)、SL202N電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 野山杏總黃酮提取液制備

干燥后的野山杏果肉粉碎過40目篩，加入50%乙醇(料液比為1∶50)超聲1 h，提取2次，抽濾，合并濾液，旋轉蒸發揮干乙醇即得到總黃酮粗提物，然后用蒸餾水將總黃酮粗提物稀釋成不同質量濃度的待測液。

1.2.2 標準曲線的建立及樣品總黃酮含量測定

1.2.2.1 對照品儲備液制備

精確量取25.00 mg蘆丁標準品于深色容量瓶中，并用60%乙醇定容于100 mL棕色容量瓶中，混勻，即得濃度為0.25 mg/mL的蘆丁標準品溶液。

1.2.2.2 線性關系[15, 16]

精密吸取制得的蘆丁標準品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別置于25 mL棕色容量瓶中，滴加5% NaNO2溶液0.7 mL，混勻室溫靜置6 min，滴加10% Al(NO3)3溶液0.7 mL，混勻室溫靜置6 min，加4% NaOH溶液4 mL后混勻，用60%乙醇定容至刻度并于室溫下靜置15 min，在510 nm波長下用紫外可見分光光度計測定吸光值A，回歸方程為y=13.851x-0.016 8，r2=0.999 4，線性關系良好。

1.2.3 不同型號吸附樹脂的篩選

1.2.3.1 大孔吸附樹脂的預處理[17]

將4種大孔吸附樹脂(AB-8、D-101、NAK-9、ADS-17)用蒸餾水清洗除去雜物及破碎樹脂， 95%乙醇浸泡24 h后蒸餾水沖洗至無醇味。用5% HCl溶液浸泡6 h后用蒸餾水清洗至pH值為中性，再用5% NaOH溶液浸泡6 h后用蒸餾水清洗至pH值為中性，備用。

1.2.3.2 靜態吸附-解吸性能[18]

(1)準確稱量處理好的樹脂各10.0 g置于錐形瓶中，分別加入野山杏總黃酮粗提液40 mL，在100 r/min，37℃恒溫振蕩24 h，充分吸附后抽濾并收集濾液，測量濾液吸光度值，計算濾液中總黃酮質量濃度量和比吸附量。

比吸附量=(樹脂吸附前總黃酮質量濃度-樹脂吸附后總黃酮質量濃度)×溶液體積/樹脂質量。

(2)各取2 g吸附飽和樹脂于100 mL錐形瓶中，精確加入50 mL 95%乙醇，在150 r/min，25℃下恒溫振蕩24 h，充分解吸后抽濾收集濾液，測定解吸液中野山杏總黃酮的質量濃度及解吸率。

比解吸量= (解吸液中總黃酮質量濃度×解吸液體積)/樹脂質量。

解吸率(%)=比解吸量/比吸附量×100%。

1.2.4 D-101大孔吸附樹脂純化工藝

1.2.4.1 徑高比

將野山杏總黃酮粗提液以1.0 mL/min的流速通過不同徑高比(1∶4，1∶6，1∶8)的大孔樹脂柱，吸附完全后用蒸餾水洗脫，再用80%乙醇洗脫，以洗脫液總黃酮含量為指標分析不同徑高比對純化工藝的影響。

1.2.4.2 最大體積

將野山杏總黃酮粗提液按1.0 mL/min的流速通過大孔樹脂柱，分段收集流出溶液，計算流出液總黃酮含量。以野山杏總黃酮的泄漏量為指標考察樣品溶液的最大上樣量。

泄露百分數(%)=流出液總黃酮含量/上樣液總黃酮含量×100%。

1.2.4.3 上樣流速

將200 mL上樣液分別以0.5、1.0、1.5 mL/min的流速上樣，測量上樣前后總黃酮的含量，以野山杏總黃酮吸附量為指標考察上樣速度對純化工藝的影響。

吸附量(mg)=上樣液總黃酮含量-流出液總黃酮含量。

1.2.4.4 上樣濃度

配置濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的野山杏總黃酮溶液上樣，上樣完全后用80%乙醇洗脫劑進行洗脫，收集洗脫溶液，以洗脫溶液中的總黃酮含量為指標，分析上樣濃度對純化工藝的影響。

1.2.4.5 吸附時間

以濃度為0.3 mL/min的野山杏總黃酮溶液上樣后，分別靜置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，然后用80%乙醇進行洗脫，收集洗脫樣液，以洗脫溶液中的總黃酮含量為指標，分析吸附時間對純化工藝的影響。

1.2.4.6 水洗脫液體積

上樣完成后用蒸餾水控制流速除去保留在樹脂柱中的多糖，多糖鑒定方法為Molish反應法。當Molish反應為陰性，在510 nm處無吸收時，測量蒸餾水體積。

1.2.4.7 水洗脫液流速

上樣吸附后用蒸餾水以0.5、1.0、1.5 mL/min流速進行洗脫，計算水洗脫液中總黃酮泄露百分數，以泄露百分數為指標分析水洗液流速對純化工藝的影響。

1.2.4.8 洗脫劑的濃度

以濃度為0.3 mg/mL的野山杏總黃酮溶液160 mL上樣，靜止2 h后用蒸餾水洗脫，依次用50%、60%、70%、80%、90%體積濃度的乙醇溶液進行洗脫后，收集洗脫液，計算解吸率。以解吸率為指標，分析洗脫劑的濃度對純化工藝的影響

1.2.4.9 洗脫劑流速

上樣吸附后，用80%乙醇溶液分別以0.5、1.0、1.5 mL/min的流速洗脫。以洗脫液中總黃酮含量為指標分析洗脫流速對純化工藝的影響。

1.2.4.10 洗脫劑體積

上樣吸附后，用80%體積濃度的乙醇溶液分別以0.5 mL/min的流速洗脫，分段收集洗脫液，每5 mL為1份，以總黃酮含量為指標考察洗脫劑的用量。

1.2.4.11 精制品總黃酮的含量

按照單因素最佳的上樣和洗脫條件，以最終提取物中野山杏總黃酮的含量為考察指標進行平行試驗(n=3)，驗證實驗的可重復性。

1.3 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對數據進行整理分析。

2 結果與分析

2.1 不同大孔吸附樹脂靜態比吸附量及比解吸附量

研究表明，D-101大孔吸附的比吸附量為1.364 mg/g、比解吸附量為0.197 mg/g、解吸率為14.44%。均優于其他3種樹脂，故選擇D-101大孔吸附樹脂對野山杏總黃酮進行分離純化。表1

表1 4種大孔樹脂對野山杏總黃酮靜態比吸附量及比解吸量測定Table 1 Determination of specific adsorption capacity and specific desorption capacity of four kinds of macroporous resins on total flavonoids of Armeniaca sibirica(L.)Lam

2.2 徑高比對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

研究表明，當大孔樹脂柱徑高比為1∶6時，洗脫液中野山杏總黃酮含量最高，選擇徑高比為1∶6的大孔樹脂柱作為純化樹脂柱。表2

表2 徑高比變化Table 2 Inspection results of the ratio of height to height

2.3 不同上樣體積下大孔吸附樹脂純化工藝的變化

研究表明，當樣品體積大于160 mL時，流出液中總黃酮含量明顯增多，此時總黃酮開始明顯泄漏。野山杏提取液的最大上樣量為160 mL，即6.3 BV(6.3倍柱體積)。圖1

圖1 泄漏曲線Fig.re1 Leakage curve

2.4 上樣流速對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

研究表明，上樣流速為1.0 mL/min時與0.5 mL/min時，野山杏總黃酮吸的附量無明顯差別，采樣速率為1.0 mL/min作為最佳上樣流速。表3

表3 上樣流速Table 3 Sample flow rate

2.5 上樣濃度對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

研究表明，當上樣液濃度達到0.3 mg/mL時，洗脫液中總黃酮含量達到最大，隨后當上樣液濃度繼續增大時洗脫液中總黃酮含量逐漸降低，最佳上樣濃度為0.3 mg/mL。表4

表4 上樣濃度Table 4 Sample Concentration Inspection Results

2.6 吸附時間對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

上樣后，靜置吸附時間2 h時，吸附效果最佳，故選擇吸附2 h為最佳吸附時間。表5

表5 吸附時間Table 5 Inspection results of adsorption time

2.7 水洗脫液體積對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

研究表明，當收集到5 BV時觀察Molish反應為陰性，同時在510 nm處無吸收，此時還原糖已去除且無總黃酮成分流出。確定水洗脫液用量為5 BV。

2.8 水洗脫液流速對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

當水洗液流速為0.5 mL/min時洗脫效果最佳，但由于三組數據差別不顯著，故選擇1.5 mL/min為洗脫條件。表6

表6 水洗脫液流速下泄露百分數Table 6 Effect of Washing Fluid Flow Rate on Leakage Percentage

2.9 洗脫劑濃度對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

因為D101大孔吸附樹脂是弱極性樹脂，而低濃度的乙醇極性較大，根據相似相容原理，應選擇極性較小的高濃度乙醇[19]，解吸率隨乙醇體積分數的增加而平緩上升，當乙醇體積分數為80%后，總黃酮的洗脫效果差異不大。洗脫劑濃度為80%乙醇。圖2

圖2 不同乙醇濃度下解吸率Fig.2 Effect of different ethanol concentration on desorption rate

2.10 洗脫劑流速對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

洗脫液流速為0.5 mL/min時洗脫效果最優，故選擇0.5 mL/min為最佳洗脫流速。表7

表7 洗脫流速考察結果Table 7 Flow rate of the elution flow

2.11 洗脫劑體積對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

研究表明，當洗脫劑用量為50 mL時，即2 BV趨于洗脫終點。確定2 BV(50 mL)為最佳洗脫量。圖3，圖4

2.12 驗證試驗

研究表明，通過D-101大孔樹脂的分離純化，野山杏總黃酮含量達到52.37%。表8

圖3 洗脫劑用量Fig.3 Eluent Usage Survey Results

表8 總黃酮含量Table 8 Total flavonoid content results

3 討 論

大孔樹脂具有吸附能力強且易洗脫、可循環使用且再生處理經濟環保、方便制劑成型等優勢，近年來大量用于天然產物中有機成分的分離純化[15]。許志新等[16]研究發現，D101大孔樹脂能將紫玉米穗軸中花青素含量由粗提物中的0.74%純化至29.76%，提高近40倍。不同極性、不同孔徑的樹脂其相應的適應范圍不同，因此，對于不同成分的分離純化的性能也是有所差異[20]。崔新梅等[18]通過對比8種大孔樹脂發現，AB-8型樹脂對敗醬草中黃酮類化合物有較好的吸附效果。王慧芳等[19]研究發現，非極性大孔樹脂HP-20更適合分離純化陳皮黃酮。野山杏是新疆廣泛分布的一種特色植物，具有豐富的營養價值，總黃酮是其有效成分之一。但野山杏醇提物中總黃酮含量較低，很難用于商業化，而大孔吸附樹脂技術因較為廣泛地應用于總黃酮分離純化，且效果顯著、工藝簡單穩定、成本較低，所以為野山杏中總黃酮成分的工業化生產提供了更多可能[21, 22]。

4 結 論

篩選出D101型大孔樹脂為最適合野山杏總黃酮的富集，最佳工藝為：最大上樣量為6.3BV，上樣速度為1.0 mL/min，上樣濃度為0.3 mg/mL，大孔吸附樹脂吸附靜止2 h后，用5 BV的蒸餾水以即1.5 mL/min的流速洗脫，棄去水洗脫液，再以0.5 mL/min流速，2 BV用量的80%乙醇進行洗脫，將洗脫液干燥得深棕色固形物，經 D-101型大孔樹脂純化后的野山杏總黃酮含量為52.37%。